做過qPCR（熒光定量PCR）的小伙伴，可能會遇到這樣的問題，明明已經(jīng)按照文獻的方法，照搬PCR引物，可還是每次結(jié)果都不一樣。

其實原因有這么幾個：

有些小伙伴可能會說，移液槍使用多么簡單，怎么可能不會用？實際上，在使用移液槍，特別是微量移液槍的時候，我們往往會長期快速操作，也就是說在彈簧還沒來得及恢復的時候，我們已經(jīng)又按了一下了。這樣可能導致的結(jié)果不用我多說，首先可能會導致……指關(guān)節(jié)受傷。當然，這些只是其次，最重要的是會影響移液量。

所以，關(guān)愛拇指，吸取液體時，保持1-2秒，給彈簧一個緩沖。當然，在加模板的時候，提高模板加樣量，也可以盡可能減少每次加樣的誤差。

吸取液體的時候，需要把槍頭插入凹液面底部，而不是插到凹液面的側(cè)面。側(cè)面比較容易產(chǎn)生氣泡：

當然，你會說，每次槍頭都插很深（莫名其妙覺得是在開車），但是這樣的話，就很容易在槍頭上沾上液滴，在微量的模板加樣時，很容易導致加樣量的誤差。

二、RNA的降解，也就是RNA完整性的問題  

RNA的完整性，一般體現(xiàn)在電泳過程中18S和28S的亮度上，如果這兩個條帶的RNA亮度變低，甚至沒有，就說明RNA的完整性應該會有損失。（但實際上現(xiàn)在沒人去跑電泳）導致RNA完整性受損的原因有很多，比如：

包括鎂離子，pH，溫度，紫外線，福爾馬林等等都會對你的RNA產(chǎn)生影響。所以，要處處小心。于是有人做了這樣的實驗，就是對于RNA的降解，有沒有什么方法可以降低RNA降解對于qPCR的影響。

他們分別分析了3`端和5`端的擴增CT值，以及長片段和短片段的ΔCT，發(fā)現(xiàn)RNA的完整性缺失與3`端和5`端沒多大關(guān)系，但是短片段會比長片段擴增效率更高。所以，qPCR引物設(shè)計的過程中，盡量把片段設(shè)計得短一點。

三、抑制物，這點相對難解決               

在反轉(zhuǎn)錄過程中或者PCR過程中都可能有抑制物，這些抑制物，比如Na離子，EDTA，SDS，酚，血紅素，腐植酸等等，都會對qPCR結(jié)果產(chǎn)生影響。具體體現(xiàn)在擴增曲線里會是這樣：

實際上去除抑制劑也只能在抽提的過程中盡量洗脫掉抑制劑，別的操作過程中其實也沒什么辦法（加促進劑可能又會產(chǎn)生不穩(wěn)定因素）。

我們往往謹慎對待：引物、探針、Ct 值等，但也有一些小東西會被忽視，比如：ROX™。也許很多同學的第一反應是：總聽人說起 ROX™，但它是什么？它在熒光定量 PCR 里起到什么作用呢？

其實和 FAM™、VIC™、SYBR™ Green 類似，ROX™ 也是一種在 qPCR 反應中能被 qPCR 儀檢測到的熒光染料分子。但與其他染料不同，ROX™ 是一種惰性參比染料，也就是說，其熒光信號并不隨著 PCR 擴增而增強。相反，ROX™ 的熒光信號值在反應中是基本保持不變的。

四、ROXTM  有什么問呢？             

其實，在 qPCR 反應中有許多反應本身的物理因素會影響信號檢測，從而造成孔間數(shù)據(jù)的差異。例如：PCR 反應板本底信號不均一，PCR 管蓋厚度有差異，同一反應體系在分裝時出現(xiàn)了差異等因素。ROX™ 能幫助我們通過均一化校正消除這些因素的誤差，從而提高數(shù)據(jù)精確性。

五、ROXTM  的工作原理？             

請大家注意看板上的兩個孔，我們在每個孔中加入「wan全等量」的樣本，然后進行擴增。很快，30 個循環(huán)完成了。在每一個循環(huán)中，我們的儀器都會讀取出一個熒光信號值。

理論上儀器檢測出這兩個孔的信號值應該是wan全相同的，因為剛開始的時候樣品是wan全一樣的。但實際上，由于移液器加樣存在誤差，耗材孔間不同等一系列差異，這兩孔檢測出的信號值并不相同。幸運的是，我們在兩個孔中都加了相同的 ROX™，而我們的儀器也同時讀取了 ROX™ 的信號值。

可以看到，ROX™ 信號和 qPCR 反應熒光信號都有差異。仔細思考大家會發(fā)現(xiàn)，反應本身的這些物理差異會對 ROX™ 信號和 qPCR 反應的熒光信號造成同等程度的影響。

重要的是，我們的儀器會在每一個循環(huán)中檢測每一個反應孔的這兩種信號，然后在反應結(jié)束后自動進行均一化處理。結(jié)合儀器自身的一系列熒光校準參數(shù)，最終您的數(shù)據(jù)精度會得到顯著提高。順便提一下，最終這個值也就是我們所說的 Rn 值，也表示報告基團的標準化熒光值。

六、兩個關(guān)于ROXTM  的重點：          

第一，除非有些特殊情況，Applied Biosystems™ 提供給您的熒光定量預混液已經(jīng)包含了最佳濃度的 ROX™，因此您無需再額外添加。

第二，所有 Applied Biosystems™ 實時熒光定量 PCR 軟件是默認檢測 ROX™ 并使用均一化數(shù)據(jù)，這會幫您提高數(shù)據(jù)精確性。如果您選用的試劑盒或者預混液不含 ROX™，依據(jù)您對實驗的精度的要求不同，您可以另外采購 ROX™ 摸索最佳濃度優(yōu)化實驗，您也可以將參比熒光染料選項改為 None（無），放棄 ROX 校正。在沒有 ROX™ 存在的情況下，我們建議選擇參比熒光為 None 進行數(shù)據(jù)分析。

好了，看看你的操作過程中是不是有這樣或者那樣的問題，看看你的擴增曲線是不是有比較奇怪的變化，然后，進行改進吧。