增加PCR的特異性：

1. primers design
這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的 一些條件
a. 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當(dāng)然不是說越長越好,太長的primer同樣會降低特異性,并且降低產(chǎn)量
b. GC% 40%~60%
c. 5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性
d. 避免3'端GC rich, 最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC (有人說：3' 端最好是 GC/CG/CC/GG。)
e. 避免3'端的互補(bǔ), 否則容易造成DIMER
f. 避免3'端的錯配
g. 避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)
h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時不算,但在檢測互補(bǔ)和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們
i. 使用兼并primer時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并primer,并使用 較高的primer濃度(1uM-3uM)
j. 最好學(xué)會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online design et al.
* primer的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的primer和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證primer同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比primer的 Tm低5℃。
設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的primer。
有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定primerTm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和 相鄰堿基的特性預(yù)測primer的雜交穩(wěn)定性。大部分計算器程序使用近鄰分析法。
根據(jù)所使用的公式及primer序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點?？梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少primer二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。
為獲得最佳結(jié)果，兩個primer應(yīng)具有近似的Tm值。primer對的Tm差異如果超過5℃，就會primer在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個primerTm不同，將退火溫度設(shè)定為比的Tm低5℃
或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度*行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。