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超微量紫外分光光度計的應(yīng)用

來源:杭州嘉維創(chuàng)新科技有限公司   2023年11月20日 09:31  

        超微量紫外可見分光光度計是通過檢測物質(zhì)波長處或某一波長范疇內(nèi)光的吸收度,對物質(zhì)進行定量與定量分析的儀器設(shè)備,目前已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)、藥物學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域的常用儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。  

1、核酸的定量  

  核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率的功能??梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,從而得出相應(yīng)的樣品濃度。


2、核酸的純度檢測  

  除了核酸濃度,超微量分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,如:  

(1)A260/A280的比值,用于評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。  

(2)A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。   


3、蛋白質(zhì)直接定量  

  這種方法是在280nm波長,直接測試蛋白。超微量分光光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),一般要消除320nm的"背景"信息,設(shè)定此功能"開"。與測試核酸類似,要求A280的吸光值大于0.1A,的線性范圍在1.0-1.5之間。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。  


4、比色法蛋白質(zhì)定量(顏色反應(yīng))  

  蛋白質(zhì)比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸與外加的顯色基團或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。  

比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry等幾種方法。  

由于各種方法反應(yīng)的基團以及顯色基團不一,所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。所以在選擇比色法之前,是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。  


5、OD600(菌落密度)  

  實驗室確定細菌生長密度和生長期,多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗,需要采用分光光度計準(zhǔn)確測定細菌細胞密度。通過檢測600nm處細胞生長培養(yǎng)的吸光度,從而監(jiān)測微生物或其他細胞培養(yǎng)的生長率。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負值,原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,即細菌培養(yǎng)一段時間后,與培養(yǎng)基反應(yīng),發(fā)生變色反應(yīng)。


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