siRNA轉(zhuǎn)染的常見(jiàn)問(wèn)題解答

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如何優(yōu)化siRNA轉(zhuǎn)染？轉(zhuǎn)染少量的siRNA為何很重要？在siRNA轉(zhuǎn)染過(guò)程中為何應(yīng)當(dāng)避免細(xì)胞毒性？本文收錄了與siRNA轉(zhuǎn)染相關(guān)的常見(jiàn)問(wèn)題，并附上專(zhuān)家的解答，希望能對(duì)您的實(shí)驗(yàn)有幫助。

Q：我該如何優(yōu)化siRNA轉(zhuǎn)染？

A：在實(shí)驗(yàn)室中建立RNAi和研究每一種新的細(xì)胞系時(shí)，應(yīng)當(dāng)優(yōu)化siRNA的轉(zhuǎn)染。HiPerFect Transfection Reagent Handbook中包含優(yōu)化的有用信息（www.qiagen.com/HB/HiPerFect）。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染效率可通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照（如AllStars Cell Death Control siRNA）的轉(zhuǎn)染來(lái)監(jiān)控。應(yīng)當(dāng)優(yōu)化的轉(zhuǎn)染因素包括：
試劑和siRNA的量

轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞匯合度

分析前細(xì)胞和復(fù)合物的孵育時(shí)間

Q：轉(zhuǎn)染少量的siRNA為何很重要？

A：高濃度的siRNA轉(zhuǎn)染可能產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，即siRNA影響了部分同源或非同源基因的表達(dá)。研究表明，可能會(huì)對(duì)RNAi實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生誤導(dǎo)結(jié)果的脫靶效應(yīng)可通過(guò)降低siRNA濃度而在很大程度上避免（1,2）。HiPerFect Transfection Reagent有助于siRNA的吸收，實(shí)現(xiàn)了低濃度下的基因沉默，而不損害knockdown的效率。

Q：在siRNA轉(zhuǎn)染過(guò)程中為何應(yīng)當(dāng)避免細(xì)胞毒性？

A：siRNA導(dǎo)入所引起的細(xì)胞毒性干擾了RNAi后的數(shù)據(jù)分析，因?yàn)楸硇头治霾辉倏煽俊Ｓ绊憯?shù)據(jù)分析的因素包括轉(zhuǎn)染試劑所引起的表型改變，壓力所引起的基因表達(dá)改變，以及不應(yīng)當(dāng)用于分析的死細(xì)胞的存在。

HiPerFect Transfection Reagent對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，不會(huì)引起液泡形成（這標(biāo)志著細(xì)胞進(jìn)程的破壞）。詳細(xì)的細(xì)胞周期和細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析顯示mock轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（只有HiPerFect Transfection Reagent）和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之間無(wú)差異。

Q：順式轉(zhuǎn)染和反式轉(zhuǎn)染之間有什么差別？

A：在反式轉(zhuǎn)染的步驟中，siRNA先加在平板的孔中，然后才是轉(zhuǎn)染試劑。在復(fù)合物形成之后，加入細(xì)胞。順式轉(zhuǎn)染則相反，先在孔中加入細(xì)胞，然后才是復(fù)合物。反式轉(zhuǎn)染使用廣泛，特別對(duì)于高通量實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗菀鬃詣?dòng)化，轉(zhuǎn)染前siRNA可儲(chǔ)存在孔中，且使用了較少的材料，因?yàn)椴恍枰谝粔K單獨(dú)的板上開(kāi)展siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物的形成。

順式轉(zhuǎn)染                                       反式轉(zhuǎn)染
第1步 細(xì)胞                                   第1步 核酸
第2步 轉(zhuǎn)染復(fù)合物                       第2步 HiPerFect Reagent
                                                        第3步 細(xì)胞

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