ELISA實(shí)驗(yàn)中對(duì)所使用的酶也有所要求，主要為純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專(zhuān)一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來(lái)源豐富、價(jià)格便宜、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，與抗體或抗原偶聯(lián)后需繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。此外，酶的底物應(yīng)易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定，光吸收度高。ELISA中常用的酶為辣根過(guò)氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP）。

HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18％，分子量為 44kD，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無(wú)色糖蛋白，在275nm 波長(zhǎng)處有最高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm 波長(zhǎng)處有最高吸收峰。

HRP的純度用RZ（ReinheitZahl，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm的吸光度之比，高純度的 HRP的 RZ≥3.0。應(yīng)注意的是酶變性后，RZ 可不變但活力降低，故選用酶制劑時(shí)更重要的指標(biāo)為活力。酶活力以單位表示：1 min 將1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為1個(gè)單位。HRP催化反應(yīng)：DH2 + H2O2—— D +2H2O。

OPD是在ELISA中應(yīng)用最多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點(diǎn)是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差，而且有潛在的致癌作用，使用時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。而TMB無(wú)此缺點(diǎn)，TMB經(jīng)酶作用后由無(wú)色變藍(lán)色，目測(cè)對(duì)比鮮明；加酸停止酶反應(yīng)后變黃色，可在比色計(jì)中定量；因此應(yīng)用日見(jiàn)增多。

ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。在ELISA中另一常用的酶為堿性磷酸酶。從大腸桿菌提取的AP分子量為 80kD，酶作用的最適pH為8.0；用小牛腸粘膜提取的AP分子量為100kD，最適pH為9.6。一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。

產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm 有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時(shí)間。在ELISA中應(yīng)AP系統(tǒng)，其敏感性一般高 HRP系統(tǒng)，空白值也較低。但由于獲得高純度AP較難，穩(wěn)定性較HRP低，價(jià)格較HRP高，且制備酶結(jié)合物時(shí)得率較HRP低等原因，在ELISA中一般較多采用HRP。

除HRP和AP以外，可應(yīng)用于ELISA試劑中的酶還有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。如β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘酮（4-mehtylumbelliferone），可用熒光計(jì)檢測(cè)。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可使用可產(chǎn)生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點(diǎn)是需要熒光計(jì)測(cè)定，而且如用固相載體直接作為測(cè)定容器，此載體不可發(fā)出熒光。