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干貨分享—細(xì)胞培養(yǎng)常見問題、可能原因及解決方法

來源:本生(天津)健康科技有限公司   2024年03月28日 09:22  

  干貨分享—細(xì)胞培養(yǎng)常見問題、可能原因及解決方法


  問題1:培養(yǎng)液pH 值變化太快

  可能原因:

  (1)CO2 張力不對(duì)

  (2)培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊

  (3)NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足

  (4)培養(yǎng)液中鹽濃度不正確

  (5)細(xì)菌、酵母或真菌污染



  建議解決方法:

  (1)按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度,2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3對(duì)應(yīng)CO2濃度為5% 到10%。

  (2)松開瓶蓋1/4 圈。

  (3)改用不依賴CO2 培養(yǎng)液。加HEPES 緩沖液至10 到25mM 終濃度。

  (4)在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液,在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。

  (5)丟棄培養(yǎng)物,或用抗生素除菌。

  問題2:培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀,但pH值不變

  可能原因:

  (1)洗滌劑清洗后殘留有磷酸鹽,將培養(yǎng)基成分沉淀下來

  (2)冰凍保存培養(yǎng)液

  建議解決方法:

  (1)用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿,然后滅菌。

  (2)將培養(yǎng)液加熱到37℃,搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在,丟棄培養(yǎng)液。

  問題3:培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀, 同時(shí)pH 發(fā)生變化

  可能原因:

  細(xì)菌或真菌污染

  建議解決方法

  丟棄培養(yǎng)物,或用抗生素除菌。

  問題4:培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁



  可能原因:

  (1)胰蛋白酶消化過度

  (2)支原體污染

  (3)培養(yǎng)瓶瓶底不干凈

  (4)培養(yǎng)液pH值過堿(NaHCO3分解)

  (5)消化液或培養(yǎng)液配制錯(cuò)誤、過期儲(chǔ)存、儲(chǔ)存不當(dāng)

  (6)細(xì)胞老化(如傳代前細(xì)胞已匯合導(dǎo)致失去貼附性)

  (7)接種細(xì)胞起始濃度太低或太高

  建議解決方法:

  (1)縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度。

  (2)分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物。

  (3)注意刷洗,或換用一次性塑料培養(yǎng)瓶

  (4)使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2(將培養(yǎng)液敞口放入培養(yǎng)箱也可)

  (5)重新配置消化液或培養(yǎng)液

  (6)啟用新的保種細(xì)胞

  (7)調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度

  問題5:懸浮細(xì)胞成簇

  可能原因:

  (1)培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子

  (2)支原體污染

  (3)蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解釋

  (4)DNA污染

  建議解決方法:

  (1)用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞,輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。

  (2)分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物。

  (3)用DNase I 處理細(xì)胞。

  問題6:原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染

  可能原因:

  原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染

  建議解決方法:

  培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。

  問題7:培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢

  可能原因:

  (1)由于更換不同培養(yǎng)液或血清

  (2)培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。

  (3)培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染

  (4)試劑保存不當(dāng)

  (5)接種細(xì)胞起始濃度太低

  (6)細(xì)胞已老化

  (7)支原體污染

  建議解決方法:

  (1)比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分,比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)。讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。

  (2)換入新鮮配制培養(yǎng)液,或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長因子。

  (3)用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)污染,丟棄培養(yǎng)物。或用抗生素除菌。

  (4)血清需保存在-5℃ 到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清培養(yǎng)液在2-8℃保存,并在2 周內(nèi)用完。

  (5)增加接種細(xì)胞起始濃度。

  (6)換用新的保種細(xì)胞。

  (7)分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物。

  問題8:培養(yǎng)細(xì)胞死亡



  可能原因:

  (1)培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2

  (2)培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大

  (3)細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷

  (4)培養(yǎng)液滲透壓不正確

  (5)培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積

  (6)更多原因參考問題4和問題7

  建議解決方法:

  (1)檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)CO2

  (2)檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度

  (3)取新的保存細(xì)胞種

  (4)檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓。注意:大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為260 – 350 mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。

  (5)換入新鮮培養(yǎng)液

  (6)更多解決方法參考問題4和問題7

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