1、實驗材料

（1）試劑

α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(BS-1102)、NEAA、L-谷氨酰胺、青鏈霉素、ITS、生理鹽水、PBS、EGF、β-FGF等。

（2）耗材

50ml離心管、10ml移液管、1000ul槍頭、 200ul槍頭、T25培養(yǎng)瓶、眼科手術(shù)剪、鑷子等。

（3）儀器設(shè)備

離心機(jī)、超凈工作臺、細(xì)胞計數(shù)儀、電子移液器、手動移液器等

（3）細(xì)胞來源

臍帶組織

2、實驗方法

（1）溶液配置：

α-MEM培養(yǎng)基配置： α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10% FBS+1%NEAA+1%L-谷氨酰胺+1% ITS+20 ng/ml EGF+20 ng/ml β-FGF+1%P/S。

（2）樣本采集及預(yù)處理

取臍帶組織置于生理鹽水中，清洗血液，直至溶液清澈；

將清洗干凈的臍帶組織放置于無菌培養(yǎng)皿（100mm）中，用滅菌剪刀剪成2-3cm的小段；

用生理鹽水清洗臍帶小段，同時用鑷子擠壓臍帶，擠出臍帶內(nèi)部殘留血液，直至無血液附著在臍帶表面及斷口處，將清洗干凈后的臍帶小段浸泡于含有1%P/S的PBS中備用；

用鑷子夾住臍帶小段斷口邊緣，用剪刀沿縱向剪開臍帶，可見臍帶內(nèi)部的三根血管，用PBS清洗剖開臍帶內(nèi)部的血跡；

用剪刀壓住臍帶小段邊緣，鑷子小心夾緊臍帶內(nèi)部表層的華氏通膠，輕輕撕下條狀華氏通膠，將分離出的華氏通膠組織塊浸泡于PBS清洗備用。

華氏通膠組織依次經(jīng)75%乙醇（30s）、PBS（30s）、75%乙醇（30s）、PBS（1min）后，收集于50ml離心管，加入少量基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用剪刀盡可能剪碎組織，用PBS重復(fù)清洗3次。

（3）人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)

將上述剪碎組織清洗后，按照一定比例，加入T75培養(yǎng)瓶中，輕輕搖動平鋪組織后，加入20ml α-MEM培養(yǎng)基，置于5％ CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

3、實驗結(jié)果

（1）細(xì)胞形態(tài)

經(jīng)1-2d培養(yǎng)觀察無污染后，繼續(xù)培養(yǎng)，毎3d對臍帶組織進(jìn)行半量換液，在培養(yǎng)10d是，鏡下觀察有細(xì)胞遷移出，呈短梭形、纖維樣（見圖1）。

圖1：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離10d形態(tài)，100x

持續(xù)培養(yǎng)15d后，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞基本鋪滿T75瓶，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)（見圖2）。

圖2：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離15d形態(tài)，100x

4、實驗結(jié)論

擬采用本公司的胎牛血清（BS-1102）可在15d從人臍帶組織中分離獲得原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。