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人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)分享

來源:內(nèi)蒙古金源康生物工程股份有限公司   2024年04月15日 09:57  

1、實驗材料

(1)試劑

α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(BS-1102)、NEAA、L-谷氨酰胺、青鏈霉素、ITS、生理鹽水、PBS、EGF、β-FGF等。

(2)耗材

50ml離心管、10ml移液管、1000ul槍頭、 200ul槍頭、T25培養(yǎng)瓶、眼科手術(shù)剪、鑷子等。

(3)儀器設(shè)備

離心機(jī)、超凈工作臺、細(xì)胞計數(shù)儀、電子移液器、手動移液器等

3)細(xì)胞來源

臍帶組織

2、實驗方法

(1)溶液配置:

α-MEM培養(yǎng)基配置: α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10% FBS+1%NEAA+1%L-谷氨酰胺+1% ITS+20 ng/ml EGF+20 ng/ml β-FGF+1%P/S。

(2)樣本采集及預(yù)處理

取臍帶組織置于生理鹽水中,清洗血液,直至溶液清澈;

將清洗干凈的臍帶組織放置于無菌培養(yǎng)皿(100mm)中,用滅菌剪刀剪成2-3cm的小段;

用生理鹽水清洗臍帶小段,同時用鑷子擠壓臍帶,擠出臍帶內(nèi)部殘留血液,直至無血液附著在臍帶表面及斷口處,將清洗干凈后的臍帶小段浸泡于含有1%P/SPBS備用;

用鑷子夾住臍帶小段斷口邊緣,用剪刀沿縱向剪開臍帶,可見臍帶內(nèi)部的三根血管,PBS清洗剖開臍帶內(nèi)部的血跡;

用剪刀壓住臍帶小段邊緣,鑷子小心夾緊臍帶內(nèi)部表層的華氏通膠,輕輕撕下條狀華氏通膠,將分離出的華氏通膠組織塊浸泡于PBS清洗備用。

華氏通膠組織依次經(jīng)75%乙醇(30s)、PBS30s)、75%乙醇(30s)、PBS1min)后,收集于50ml離心管,加入少量基礎(chǔ)培養(yǎng)基,用剪刀盡可能剪碎組織,PBS重復(fù)清洗3。

(3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)

將上述剪碎組織清洗后,按照一定比例,加入T75培養(yǎng)瓶中,輕輕搖動平鋪組織后,加入20ml α-MEM培養(yǎng)基,置于5 CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

3、實驗結(jié)果

(1)細(xì)胞形態(tài)

經(jīng)1-2d培養(yǎng)觀察無污染后,繼續(xù)培養(yǎng),毎3d對臍帶組織進(jìn)行半量換液,在培養(yǎng)10d是,鏡下觀察有細(xì)胞遷移出,呈短梭形、纖維樣(見圖1)。

                                     

圖片1.png  圖片2.png


1人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離10d形態(tài),100x

持續(xù)培養(yǎng)15d后,人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞基本鋪滿T75瓶,可進(jìn)行傳代培養(yǎng)(見圖2

                                     

圖片3.png 圖片4.png


2人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離15d形態(tài),100x

4、實驗結(jié)論

擬采用本公司的胎牛血清(BS-1102)可在15d從人臍帶組織中分離獲得原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。


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