成孔毒素是一類與細(xì)胞膜相互作用導(dǎo)致溶血孔的蛋白家族，對(duì)靶細(xì)胞具有致命性。在水中，蛋白質(zhì)被牢固地折疊，但在與細(xì)胞膜脂相互作用時(shí)，它們成為低聚整體膜結(jié)構(gòu)。毒素的結(jié)合取決于膜的結(jié)構(gòu)。

       多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)是一種高靈敏度、無(wú)標(biāo)記的研究表面變化的方法。脂質(zhì)囊泡層分布在傳感器表面，測(cè)量了四種?？啪€素與脂質(zhì)的相互作用。與其他兩種放線酶相比，溶血素I和II具有明顯更高的結(jié)合和成孔能力。發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中的膽固醇增加了equinatoxin II和fragaceatoxin C的結(jié)合。

概述

       生物分子相互作用是藥物發(fā)現(xiàn)和生物傳感器開發(fā)領(lǐng)域的常規(guī)測(cè)量。表面等離子體共振(SPR)是一種成熟的方法，用于測(cè)量結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)。綜合多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)儀器可以在寬角度范圍(40-78度)和多個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量，從而使MP-SPR成為測(cè)量脂質(zhì)，膜提取物和活細(xì)胞相互作用的工具。

       MP-SPR儀器的光學(xué)設(shè)置可以同時(shí)測(cè)量多個(gè)光學(xué)參數(shù)。使用PureKinetics™功能，參數(shù)的相互關(guān)系允許對(duì)干擾體信號(hào)進(jìn)行簡(jiǎn)單的在線表征，并能夠?qū)崟r(shí)校正體效應(yīng)。當(dāng)使用改變緩沖液或不存在參考表面時(shí)，例如在與脂質(zhì)層或材料的分子相互作用期間，這是非常有用的。

材料與方法

       用洗滌劑3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基氨]-1-丙磺酸清洗表面后，脂質(zhì)囊泡附著在羧甲基葡聚糖包被的傳感器載玻片上。模型脂質(zhì)系統(tǒng)含有1,2 -二甘油酯- sn-甘油- 3 -磷酸膽堿(DOPC)和鞘磷脂(SM)，含和不含膽固醇(Chol)。脂質(zhì)囊泡作用于葡聚糖表面(0.5 mM脂質(zhì)濃度)12分鐘。用50mm NaOH沖洗未結(jié)合的脂質(zhì)。牛血清白蛋白(BSA)被用作阻斷分子，以防止任何非特異性結(jié)合底物。運(yùn)行緩沖液為10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4。

       研究了三種海葵產(chǎn)生的Equinatoxin II (EqtII)、fragaceatoxin C (FraC)、sticholysins I和II (StnI和StnII)(圖1)。4.0 μM放線素作用于脂質(zhì)表面10分鐘，計(jì)算結(jié)合質(zhì)量(ng/cm2)。利用CHAPS對(duì)傳感器表面進(jìn)行再生。

圖1。?？啪€素(成孔毒素)與脂質(zhì)膜結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞死亡。采用MP-SPR法測(cè)定Equinatoxin II (EqtII)、fragaceatoxin C (FraC)、sticholysin II (StnII)和sticholysin I (StnI)與脂質(zhì)囊泡的結(jié)合。

結(jié)果和討論

      所選的放線酶具有非常相似的分子結(jié)構(gòu)。然而，孔隙形成活動(dòng)是已知的不同。根據(jù)MP-SPR測(cè)量，StnII和StnI與DOPC:SM(4:1)脂質(zhì)囊泡的結(jié)合比FraC和EqtII放線素的結(jié)合高3倍以上(圖2a)。當(dāng)膜中含有膽固醇(DOPC:SM:Chol, 1:1:1)時(shí)，F(xiàn)raC和EqtII的結(jié)合明顯增加(圖2b)。MP-SPR結(jié)果與等溫滴定量熱法(ITC)結(jié)果吻合良好(圖3)。

放線酶的成孔能力與對(duì)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的親和力有關(guān)。差異是由分子前30個(gè)n端殘基的序列變化引起的。Garcia-Linares等(2016)進(jìn)一步研究了sticholysins II色氨酸殘基對(duì)孔隙形成活性的影響。利用MP-SPR研究了天然和突變型膽溶素ii在不同脂質(zhì)組成的膜上的結(jié)合。

圖2。與equinatoxin II, fragaceatoxin C (A)相比，放線素分解酶I和分解酶II在DOPC:SM(4:1)脂質(zhì)體上的結(jié)合明顯更強(qiáng)。然而，當(dāng)脂質(zhì)成分中含有膽固醇時(shí)，EqtII和FraC的結(jié)合增加(B)。質(zhì)量值(ng/cm2)是兩次測(cè)量的平均值。DOPC = 1,2 -二油基- sn-甘油- 3 -磷酸膽堿，SP =鞘磷脂。

圖3。采用等溫滴定量熱法(ITC)研究了StnII和EqtII與DOPC:SM囊泡的結(jié)合。ITC的結(jié)果與MP-SPR的結(jié)果非常一致。

結(jié)論

       MP-SPR為毒素相互作用機(jī)制提供了有價(jià)值的信息。小分子量或大分子量毒素的相互作用可以實(shí)時(shí)和無(wú)標(biāo)簽測(cè)量。除了膜研究之外，分子與靶分子、生物材料和活細(xì)胞的相互作用也可以使用MP-SPR方法進(jìn)行研究。在相互作用測(cè)量之前，可以使用MP-SPR提供的厚度和折射率信息來(lái)確定脂質(zhì)的構(gòu)象。