蛋白質(zhì)組學(xué)研究是一項(xiàng)涵蓋蛋白質(zhì)表達(dá)、蛋白間相互作用、蛋白功能、蛋白結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾的綜合科學(xué)研究。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究具有重大的潛力，可以解開(kāi)疾病復(fù)雜機(jī)制，尋找疾病早期診斷的分子標(biāo)志物和解決方案，促進(jìn)疾病研究發(fā)展。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究在各個(gè)領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用，如臨床與健康學(xué)研究、食品技術(shù)、生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，以及藥物靶標(biāo)的鑒定。

蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜，有較高的操作和實(shí)驗(yàn)技能的要求。完整的實(shí)驗(yàn)步驟一般包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣品前處理、LC-MS/MS分析、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、生物信息學(xué)分析等多重步驟。其中蛋白質(zhì)組樣品前處理是確保數(shù)據(jù)重現(xiàn)性、一致性的關(guān)鍵，對(duì)于穩(wěn)定的下游分析至關(guān)重要。質(zhì)譜檢測(cè)多肽質(zhì)荷比，鹽類(lèi)以及其他離子化的物質(zhì)都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。同時(shí)，手工實(shí)驗(yàn)需要投入大量人工操作時(shí)間，壓縮了分析時(shí)間。此外，勞動(dòng)密集型步驟導(dǎo)致人為誤差比率增大，不同個(gè)人和實(shí)驗(yàn)室間的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性差異大，特別是在高通量條件下。自動(dòng)化樣本制備的方法可減少手動(dòng)操作時(shí)間，提高蛋白質(zhì)覆蓋率，幫助獲得高重現(xiàn)、高質(zhì)量的結(jié)果。

貝克曼庫(kù)爾特生命科學(xué)利用功能強(qiáng)大的自動(dòng)化設(shè)備和豐富的自動(dòng)化經(jīng)驗(yàn)，開(kāi)發(fā)了一套標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)流程包括變性、還原、烷基化、淬滅、稀釋、消化和脫鹽，應(yīng)用于LC-MS/MS分析全血，血漿，干血斑等樣品中產(chǎn)生的多種血漿蛋白，為不同類(lèi)型樣本用于疾病診斷、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和常規(guī)臨床分析提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)依據(jù)。

圖1：蛋白質(zhì)組學(xué)樣本自動(dòng)化處理實(shí)驗(yàn)流程

成功的蛋白質(zhì)組學(xué)分析實(shí)驗(yàn)始于精心設(shè)計(jì)的樣品前處理方法和自動(dòng)化解決方案，對(duì)于自動(dòng)化樣品前處理，Biomek i7 Hybrid自動(dòng)化樣品前處理系統(tǒng)為雙機(jī)械臂系統(tǒng)，每個(gè)機(jī)械臂同時(shí)配備移液系統(tǒng)和抓板手，2個(gè)抓板手可同時(shí)運(yùn)行。擁有45個(gè)有效標(biāo)準(zhǔn)板位的臺(tái)面容量，臺(tái)面通過(guò)簡(jiǎn)單配備溫控和震蕩功能模塊以及整合正壓固相萃取模塊，即可完成包括蛋白變性、還原、烷基化、蛋白酶解、脫鹽和肽段純化所有前處理流程。

圖2：系統(tǒng)示意圖

使用該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化蛋白質(zhì)樣品前處理，可大大減少操作差異、樣品處理錯(cuò)誤，并節(jié)省人力。預(yù)先優(yōu)化驗(yàn)證的方案支持無(wú)人值守，每個(gè)人只需通過(guò)簡(jiǎn)單的培訓(xùn)即可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。下圖為系統(tǒng)使用集成的正壓模塊進(jìn)行自動(dòng)化固相萃取，完成脫鹽流程。

本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)了一種更高效、穩(wěn)定、適用性強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組樣本制備流程，將樣品分為中等通量（20樣本/天）和高通量（57個(gè)樣品/天）通過(guò)自動(dòng)化的樣本處理流程產(chǎn)生高質(zhì)量的肽段，然后利用液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用平臺(tái)（LC-MS/MS）對(duì)肽段進(jìn)行分析，獲得3日內(nèi)、日間不同樣本的CV和不同數(shù)量的肽段。

圖4：Biomek 自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程和桌面布局（附帶正壓模塊PPA照片）

圖5：總蛋白組學(xué)工作流CV=工作站CV + LC-MS/MS CV

圖6：總蛋白組學(xué)工作流CV

自動(dòng)化樣品制備的日內(nèi)重現(xiàn)性CV：4%-20%，結(jié)果表明自動(dòng)化流程對(duì)高通量樣本處理的穩(wěn)定性滿(mǎn)足需求。

圖7：A）中通量樣品分析和肽段鑒定   

B)高通量樣本分析和肽段鑒定

每個(gè)樣本做5次重復(fù)，一共重復(fù)3日，并且利用LC-MS/MS平臺(tái)對(duì)中通量數(shù)據(jù)和高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，對(duì)于中通量樣本的研究發(fā)現(xiàn)全血樣本可鑒定出最大數(shù)量為365的肽段，對(duì)于高通量樣本的研究發(fā)現(xiàn)干血斑可鑒定出最大數(shù)量為324的肽段。

總而言之:自動(dòng)化蛋白質(zhì)組樣本前處理系統(tǒng)對(duì)于不同類(lèi)型的血液樣本（血漿，全血，血斑等），都可以獲得重現(xiàn)性高，質(zhì)量高的肽段，用于下游的定量和分析。

（備注：該自動(dòng)化平臺(tái)不僅可用于蛋白質(zhì)組學(xué)樣本研究，而且可進(jìn)一步擴(kuò)展適用于代謝組學(xué)和脂質(zhì)體的研究。）

綜上，小貝為您總結(jié)了自動(dòng)化蛋白質(zhì)組樣本前處理的優(yōu)勢(shì)：

參考文獻(xiàn)

1. Wright, I. & Van Eyk, J. E. A Roadmap to Successful Clinical Proteomics. Clinical Chemistry 63,245–247 (2017).

2. Malsagova, K. et al. Dried Blood Spot in Laboratory: Directions and Prospects. Diagnostics(Basel, Switzerland) 10, (2020).

3. Fu Q, Kowalski MP, Mastali M, et al. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 2018;17(1):420-428.doi:10.1021/acs.jproteome.7b00623.

4. Mc Ardle A, Binek A, Moradian A, Chazarin Orgel B, Rivas A. et al. Standardized Workflow for Precise Mid- and High-Throughput Proteomics of Blood Biofluids. Clinical Chemistry. 2021 Oct 23: hvab202. doi: 10.1093/clinchem/hvab202. Epub ahead of print.

5. Casey W Coutelin Johnson et al. Fully Automated Peptide Desalting for Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry Analysis Using Beckman Coulter Biomek i7 Hybrid Workstation.Beckman Coulter Life Sciences.