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細(xì)胞凋亡的過(guò)程在不同點(diǎn)受到嚴(yán)格調(diào)控，因此可以評(píng)估所涉及的不同蛋白質(zhì)的活性。由于細(xì)胞凋亡和壞死的過(guò)程可能重疊，因此必須通過(guò)兩種不同的測(cè)定來(lái)確認(rèn)細(xì)胞死亡的機(jī)制。下面讓我們一起來(lái)看看細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法吧！
1. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
用光學(xué)顯微鏡觀察蘇木精和伊紅染色的組織切片可以觀察到凋亡細(xì)胞。該方法檢測(cè)的是處于凋亡后期的細(xì)胞，但不能識(shí)別處于凋亡早期的細(xì)胞。透射電子顯微鏡(TEM)是確認(rèn)細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。
2. DNA
DNA laddering 技術(shù)是另一種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法，它使細(xì)胞凋亡過(guò)程中核酸內(nèi)切酶切割的產(chǎn)物可視化。這涉及通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳從裂解的細(xì)胞勻漿分離中提取 DNA。所得 DNA 條帶形成 DNA 階梯，可用于檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)量高的組織中的細(xì)胞凋亡。然而，DNA 發(fā)生在細(xì)胞凋亡的后期階段，因此無(wú)法檢測(cè)早期階段的細(xì)胞。另一種方法是 TUNEL(Terminal dUTP Nick End-Labeling)方法，它也通過(guò)酶法標(biāo)記 DNA 鏈的末端來(lái)檢測(cè)核酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)物。末端轉(zhuǎn)移酶用于將 dUTP 連接到 DNA 片段的 3' 端。然后用各種探針標(biāo)記 dUTP，以便通過(guò)光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。雖然這種技術(shù)很快并且可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，但它可能會(huì)因壞死細(xì)胞而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。
3. caspases、裂解底物、調(diào)節(jié)劑和抑制劑的檢測(cè)
可以使用各種類型的半胱天冬酶活性測(cè)定來(lái)檢測(cè)超過(guò) 13 種已知的參與細(xì)胞凋亡的半胱天冬酶。一些免疫測(cè)定可以檢測(cè)裂解的底物，如 PARP 和已知的細(xì)胞修飾，如磷酸化組蛋白。包括蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和免疫組織化學(xué)在內(nèi)的多種測(cè)定可用于檢測(cè)半胱天冬酶活化。Apoptosis PCR microarray是一種較新的方法，它使用real-time PCR來(lái)指示大約112個(gè)參與細(xì)胞凋亡的基因的表達(dá)。微陣列旨在生成編碼必需受體、配體、細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑和參與程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子的基因的表達(dá)譜。
4. 線粒體檢測(cè)
證明細(xì)胞色素c釋放的線粒體測(cè)定 允許檢測(cè)內(nèi)在途徑早期階段的變化。激光掃描共聚焦顯微鏡 (LSCM) 創(chuàng)建活細(xì)胞的薄光學(xué)切片，然后用于監(jiān)測(cè)一段時(shí)間內(nèi)完整單細(xì)胞中的各種線粒體事件。該技術(shù)可測(cè)量線粒體通透性、線粒體內(nèi)膜去極化、線粒體氧化還原狀態(tài)、Ca2+通量和活性氧等參數(shù)。
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