文中對(duì)表達(dá)FUCCI2的腸類器官進(jìn)行了活體成像，并進(jìn)行了終點(diǎn)固定和免疫熒光評(píng)估其細(xì)胞類型組成。通過(guò)3D配準(zhǔn)將最后一個(gè)活體成像時(shí)間點(diǎn)與染色后的類器官疊加，使用Paneth細(xì)胞標(biāo)記溶菌酶（Lys）和分泌細(xì)胞標(biāo)記Dll1來(lái)檢測(cè)感興趣的細(xì)胞。三重陽(yáng)性細(xì)胞（hCdt1+/Lys+/Dll1+）被反向追蹤以監(jiān)測(cè)Paneth細(xì)胞的成熟及其在G0/G1期的細(xì)胞周期停滯。成熟Paneth細(xì)胞的初始位置預(yù)測(cè)了類器官隱窩的最終位置。

接下來(lái)，比較了隱窩中的hCdt1+/Lys+/Dll1+ Paneth細(xì)胞與hCdt1+/Lys?/Dll?細(xì)胞（主要是腸干細(xì)胞）和類器官絨毛中的細(xì)胞（主要是腸細(xì)胞）。進(jìn)一步識(shí)別了那些在記錄開(kāi)始前已經(jīng)終末分化的腸細(xì)胞和Paneth細(xì)胞。對(duì)于其他細(xì)胞，特別是在隱窩中的細(xì)胞，確定了它們出現(xiàn)的時(shí)間，從而能夠追蹤它們的完整成熟過(guò)程，固定時(shí)的平均細(xì)胞周期長(zhǎng)度為21.9小時(shí)。評(píng)估細(xì)胞類型特定的出現(xiàn)時(shí)間，得出結(jié)論，Paneth細(xì)胞比單陽(yáng)性hCdt1細(xì)胞出現(xiàn)得更早，表明特定的細(xì)胞周期長(zhǎng)度和特定的分化順序。這種對(duì)細(xì)胞行為和成熟過(guò)程的洞見(jiàn)在沒(méi)有活體成像和免疫熒光結(jié)合整個(gè)類器官體積的情況下是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。

與其他樣本不同，胚狀體是密集結(jié)構(gòu)，因此難以單細(xì)胞分辨率成像。文中使用這個(gè)模型系統(tǒng)展示顯微鏡獲取單個(gè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和形態(tài)特征的能力。標(biāo)準(zhǔn)胚狀體實(shí)驗(yàn)方案使用Wnt激活劑（Chiron99021）以提高中胚層形成效率。這可能會(huì)誘導(dǎo)類似上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的行為并增加細(xì)胞遷移。為了分析胚狀體內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)，文中生成了嵌合體，其中一部分細(xì)胞（約10%）表達(dá)膜報(bào)告基因（Lck-GFP）。記錄胚狀體在Wnt脈沖前、中和后的動(dòng)態(tài)。此外，將胚狀體嵌入40%的Matrigel中，以防止樣本腔室中的機(jī)械旋轉(zhuǎn)。使用Cellpose對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行3D分割，從而計(jì)算長(zhǎng)軸/短軸比率，顯示細(xì)胞伸長(zhǎng)在Chir處理期間達(dá)到峰值。

后期階段，部分細(xì)胞顯示出較長(zhǎng)的細(xì)胞突起。這一觀察結(jié)果提出了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性在胚狀體發(fā)育過(guò)程中增加的假設(shè)。使用Fiji插件Mastodon，追蹤了Lck-GFP陽(yáng)性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)遷移的中位速度在胚狀體發(fā)育過(guò)程中增加。在Wnt脈沖期間，遷移速度的中位數(shù)增加了1.4倍。Wnt激活后成像的胚體展示了最長(zhǎng)的軌跡長(zhǎng)度。對(duì)3D均方位移的評(píng)估表明，從90小時(shí)開(kāi)始追蹤的細(xì)胞速度增加，并且遷移行為發(fā)生了變化。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，遷移增加，提示W(wǎng)nt激活增強(qiáng)了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性并可能在胚體中促進(jìn)了協(xié)調(diào)遷移。觀察到的細(xì)胞形態(tài)變化和運(yùn)動(dòng)性增加，部分表明了類似上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程。這一趨勢(shì)在嵌入Matrigel中的胚體和懸浮狀態(tài)下的胚體之間保持一致。

開(kāi)放式設(shè)計(jì)和可定制的樣本支架提供了處理不同類型樣本和實(shí)驗(yàn)設(shè)置的靈活性。這種適應(yīng)性使顯微鏡適用于從類器官研究到發(fā)育生物學(xué)和癌癥研究的廣泛生物學(xué)研究。

開(kāi)放式多樣本雙視角光片顯微鏡代表了實(shí)時(shí)成像技術(shù)的重大進(jìn)展。未來(lái)的增強(qiáng)可能包括整合自適應(yīng)光學(xué)以進(jìn)一步提升圖像質(zhì)量，以及結(jié)合激光消融或光遺傳刺激技術(shù)以在成像過(guò)程中操縱樣本。此外，該系統(tǒng)處理光學(xué)透明標(biāo)本的能力可能擴(kuò)展其在深層組織成像中的應(yīng)用。

開(kāi)放式多樣本雙視角光片顯微鏡的開(kāi)發(fā)和成功應(yīng)用標(biāo)志著生物成像領(lǐng)域的關(guān)鍵一步。通過(guò)在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)提供大型多細(xì)胞系統(tǒng)的高分辨率三維圖像，這一技術(shù)為理解細(xì)胞水平上的復(fù)雜生物過(guò)程開(kāi)辟了新的途徑。