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N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物mRNA中的化學(xué)修飾，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。m6A是一種可逆修飾，分別由甲基轉(zhuǎn)移酶(writer)、去甲基化酶(eraser)和m6A結(jié)合蛋白(reader)進(jìn)行添加、去除和識別。

m6A檢測技術(shù)的發(fā)展是研究m6A功能的基礎(chǔ)。薄層色譜（TLC）、斑點印跡（dot-blots）以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）是廣泛用于檢測RNA m6A整體水平變化的方法。然而這些方法無法分析m6A在轉(zhuǎn)錄組水平上的分布，也無法識別特定基因中的m6A位點。以下內(nèi)容將介紹關(guān)于高通量m6A測序技術(shù)和單基因m6A位點的檢測方法。

高通量m6A測序技術(shù)

盡管對于DNA化學(xué)修飾有許多檢測方法，但開發(fā)用于RNA m6A測序方法還是存在一些困難。首先，RNA不能直接擴(kuò)增，必須首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。但m6A結(jié)構(gòu)不影響正常堿基配對，m6A位點信息可能在逆轉(zhuǎn)錄過程中丟失。其次，盡管m6A是真核mRNA中含量的修飾，但其含量非常低，并且在細(xì)胞中仍有大量的核糖體RNA（rRNA）和轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）干擾。因此，需要通過高度特異性的方法在復(fù)雜系統(tǒng)中富集m6A RNA。目前已經(jīng)開發(fā)出多種m6A的高通量測序技術(shù)，促進(jìn)了RNA修飾的功能研究。

（1）抗體依賴性m6A測序方法

MeRIP-seq/m6A-seq 是使用m6A抗體開發(fā)的高通量測序技術(shù)。該技術(shù)通過mRNA片段化成100-200個核苷酸（nt），然后與m6A抗體孵育，洗脫的RNA用于構(gòu)建文庫和測序。甲基化區(qū)域在免疫沉淀RNA相對于input RNA的轉(zhuǎn)錄覆蓋率稱為peaks（圖1A）。MeRIP-seq/m6A-seq 生成了約200個nt分辨率的m6A信息。MeRIP-seq/m6A-seq操作簡單，所有試劑均已商品化；因此，它一直是m6A測序的方法。

2021年有研究團(tuán)隊開發(fā)了一種升級版的MeRIP-seq/m6A-seq方法，稱為m6A-seq2。m6A-seq2不是一次對一個樣本進(jìn)行m6A免疫沉淀（m6A-IP），而是對合并RNA樣本進(jìn)行m6A-IP。帶有條形碼的RNA接頭被連接到不同樣本的片段化RNA上，然后在合并樣本上執(zhí)行單個抗m6A-IP，然后根據(jù)條形碼序列分配原始樣本的reads（圖1A）。m6A-seq2所有m6A-IP都在單管中進(jìn)行，可以減少技術(shù)變異性、樣本起始量和文庫制備成本。此外，考慮到不同樣本之間對固定數(shù)量抗體的競爭，m6A-seq2可能能夠?qū)崿F(xiàn)不同樣本之間m6A整體水平的比較。

m6A單堿基分辨率交聯(lián)和免疫沉淀方法（m6A-CLIP/miCLIP）可以成功生成單堿基分辨率的m6A位點信息。該方法片段化的RNA與m6A抗體孵育，然后RNA-抗體復(fù)合物通過254 nm UV光交聯(lián)，通過蛋白酶消化得到的氨基酸殘基抑制逆轉(zhuǎn)錄中的堿基配對，導(dǎo)致在m6A位點附近發(fā)生片段化或突變，最終以單堿基分辨率獲得m6A位點信息（圖1A）?？贵w和RNA的結(jié)合效率以及交聯(lián)效率將對最終的測序結(jié)果產(chǎn)生重大影響。此外，交聯(lián)主要發(fā)生在抗體的芳香族氨基酸和RNA的嘧啶堿基之間。因此，m6A-CLIP/miCLIP不是直接鑒定單m6A位點，而是從相鄰嘧啶位點突變中進(jìn)行推斷；無法準(zhǔn)確定位多個相鄰腺苷中的m6A，且很難對群集m6A分布進(jìn)行分析。

圖1：高通量m6A測序技術(shù)

A. 基于抗體的m6A測序方法示意圖：MeRIP-seq/m6A-seq、m6A-seq2和m6A-CLIP/miCLIP。

B. 抗體非依賴性m6A測序方法示意圖：m6A SEAL-seq、m6A SAC-seq、Nanopore Direct RNA-seq和GLORI-seq。

（2）抗體非依賴性測序技術(shù)

基于抗體的m6A高通量測序技術(shù)存在明顯的缺點：m6A抗體質(zhì)量不易控制，使用不同制造商的抗體獲得結(jié)果差異較大。此外，抗體的高價格和測序所需的大量RNA也阻礙其大規(guī)模應(yīng)用。為了克服這些局限，科研人員也提出了多種抗體非依賴性m6A高通量測序方法。

FTO輔助的m6A選擇性化學(xué)標(biāo)記方法（m6A-SEAL-seq）利用去甲基化酶FT的特性，在體外對m6A進(jìn)行標(biāo)記。FTO用于將m6A氧化為中間產(chǎn)物hm6A，hm6A進(jìn)一步與二硫蘇糖醇（DTT）轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的N6-二硫代硫醇甲基腺苷（dm6A）。然后用生物素標(biāo)記dm6A以富集含有原始m6A的RNA片段。對富集的RNA進(jìn)行測序以獲得m6A位點信息（圖1B）。m6A-SEAL-seq所需初始RNA量很低，FTO具有很強(qiáng)大的去甲基化活性，幾乎沒有序列選擇性。m6A-SEAL-seq的缺點是操作步驟多、耗時長、分辨率與MeRIP-seq相似。

選擇性丙烯基化學(xué)標(biāo)記測序（m6A-SAC-seq）可以直接標(biāo)記m6A，覆蓋幾乎所有m6A經(jīng)典motif，并以單堿基分辨率定量分析捕獲的m6A位點。該方法使用特定酶將烯丙基化學(xué)基團(tuán)添加到m6A中，形成a6m6A，經(jīng)I2處理后進(jìn)行環(huán)化。在逆轉(zhuǎn)錄過程中，環(huán)化的a6m6A被逆轉(zhuǎn)錄酶讀為突變?；谕蛔兾稽c檢測轉(zhuǎn)錄組中的m6A位點，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換突變率來獲得m6A含量的準(zhǔn)確信息（圖1B）。m6A-SAC-seq可廣泛應(yīng)用于各種生物學(xué)背景，并在基礎(chǔ)生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用中具有良好前景。m6A-SAC-seq的主要局限在于反應(yīng)基于酶，因此可能具有序列偏好。

納米孔直接RNA測序（Nanopore Direct RNA-seq）是另一種能夠以單堿基分辨率鑒定m6A修飾的測序技術(shù)。當(dāng)RNA通過納米孔時，通過納米孔表面的電場強(qiáng)度鑒定RNA序列。RNA修飾導(dǎo)致強(qiáng)度水平變化，因此可以通過以單堿基分辨率計算確定修飾堿基（圖1B）。盡管Nanopore Direct RNA-seq能夠在單堿基水平上鑒定m6A修飾，但仍存在一些缺點，如成本高、準(zhǔn)確性低、對RNA質(zhì)量和初始量要求較高。

乙二醛和亞硝酸鹽介導(dǎo)的未甲基化腺苷脫氨酶測序（GLORI-seq）是最近報道的技術(shù)；它能夠高效且無偏倚檢測單堿基m6A位點，并定量m6A修飾水平。GLORI技術(shù)使用乙二醛和亞硝酸鹽的催化系統(tǒng)高效地將未甲基化腺苷脫氨形成肌苷（A到I，>98%）。肌苷在逆轉(zhuǎn)錄過程中與胞嘧啶匹配，隨后在測序過程中被讀為鳥苷（G），產(chǎn)生A-to-G轉(zhuǎn)化。而m6A保持不變，在測序后仍被讀為A。因此，GLORI通過檢測測序reads中A的比例，實現(xiàn)了對單堿基m6A的定量（圖1B）。

單基因m6A位點的檢測

盡管高通量測序技術(shù)能夠快速獲得數(shù)千個m6A位點數(shù)據(jù)，但由于測序過程中的偏倚或技術(shù)原理上的缺陷，它們?nèi)匀粫a(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。因此，有必要開發(fā)檢測單基因m6A位點的方法。

MeRIP-qRT-PCR已被廣泛用于驗證高通量測序鑒定的m6A peaks。mRNA或總RNA被片段化為100-200nt，隨后用m6A抗體進(jìn)行免疫沉淀，富集的RNA通過常規(guī)qRT-PCR進(jìn)行定量（圖2）。盡管MeRIP-qRT-PCR簡單實用，但它不能提供單堿基分辨率，并且依賴于m6A抗體的特異性。

基于單堿基延伸和連接的qPCR擴(kuò)增方法（SELECT）利用m6A抑制DNA聚合酶和連接酶的特性，方便快速地檢測特定位點的m6A修飾及程度。SELECT使用DNA聚合酶和連接酶連接靶位點的兩個互補(bǔ)DNA引物。在這個過程中，m6A首先干擾上游引物的延伸，然后阻礙下游引物的連接。盡管m6A不會抑制每一步，但通過兩步反應(yīng)可以大幅減少最終產(chǎn)物量。最終，通過qRT-PCR分析目標(biāo)位點和對照組的閾值循環(huán)（Ct）的差異，可以檢測目標(biāo)位點的m6A修飾和甲基化程度（圖2）。SELECT操作簡便，所有實驗都可以在一個反應(yīng)系統(tǒng)中完成，無需額外的純化步驟。但SELECT需要引入對照組并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線以完成檢測和定量分析。

位點特異性切割和放射性標(biāo)記，隨后通過連接輔助提取和TLC（SCARLET）可以以單堿基分辨率定量檢測RNA中的修飾位點，這目前是RNA修飾的“金標(biāo)準(zhǔn)”。因為RNase H會消化RNA/DNA雜交體中的RNA，但不消化RNA/2-O-甲基化DNA雜交體中的RNA，使用RNase H暴露于預(yù)定義的m6A位點進(jìn)行放射性標(biāo)記。使用DNA連接酶將32P標(biāo)記的RNA片段連接到116個核苷酸的單鏈DNA寡核苷酸上。然后用RNase T1/A處理樣品以消化所有RNA，而32P標(biāo)記的預(yù)定義m6A位點保持不變。經(jīng)過凝膠純化和核酸酶P1消化后，通過TLC確定m6A修飾狀態(tài)（圖2）。SCARLET技術(shù)的應(yīng)用受到其復(fù)雜步驟、長實驗時間和使用放射性試劑的限制。

圖2：單基因m6A位點檢測方法

位點特異性m6A檢測方法示意圖：MeRIP-qRT-PCR、SELECT和SCARLET。

總結(jié)而言，目前已經(jīng)開發(fā)出的不同層面m6A修飾檢測方法主要有：

1）整體水平檢測：TLC、Dot-blot和LC-MS/MS；

2）轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)m6A修飾高通量檢測（圖1）：

a)基于特異性抗體的測序技術(shù)（MeRIP-seq/m6A-seq、m6A-seq2、m6A-CLIP/miCLIP）；

b)非抗體依賴的測序技術(shù)（m6A-SEAL-seq、m6A-SAC-Seq、Nanopore Direct RNA Seq、GLORI-Seq）；

3)單基因m6A位點檢測技術(shù)：MeRIP-qRT-PCR、SELECT、SCARLET（圖2）。

以上方法有不同的應(yīng)用場景，科研老師們可以根據(jù)自己的科研需求選擇適合的檢測方法。

參考文獻(xiàn)：

Tang J, Chen S, Jia G. Detection, regulation, and functions of RNA N6-methyladenosine modification in plants. Plant Commun. 2023 May 8;4(3):100546. pii: S2590-3462(23)00044-5. doi: 10.1016/j.xplc.2023.100546. PubMed PMID: 36627844.