精品国产亚洲国产亚洲,久热中文在线观看精品视频,成人三级av黄色按摩,亚洲AV无码乱码国产麻豆

產(chǎn)品推薦:氣相|液相|光譜|質(zhì)譜|電化學|元素分析|水分測定儀|樣品前處理|試驗機|培養(yǎng)箱


化工儀器網(wǎng)>技術(shù)中心>其他文章>正文

歡迎聯(lián)系我

有什么可以幫您? 在線咨詢

RNA m6A甲基化修飾和特定基因m6A位點的檢測方法|干貨分享

來源:深圳市易基因科技有限公司   2024年08月13日 14:50  

大家好,這里是專注表觀組學十余年,多組學科研服務的易基因。

 

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物mRNA中的化學修飾,在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。m6A是一種可逆修飾,分別由甲基轉(zhuǎn)移酶(writer)、去甲基化酶(eraser)m6A結(jié)合蛋白(reader)進行添加、去除和識別。

 

m6A檢測技術(shù)的發(fā)展是研究m6A功能的基礎(chǔ)。薄層色譜(TLC)、斑點印跡(dot-blots)以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)是廣泛用于檢測RNA m6A整體水平變化的方法。然而這些方法無法分析m6A在轉(zhuǎn)錄組水平上的分布,也無法識別特定基因中的m6A位點。以下內(nèi)容將介紹關(guān)于高通量m6A測序技術(shù)和單基因m6A位點的檢測方法。

 

高通量m6A測序技術(shù)

盡管對于DNA化學修飾有許多檢測方法,但開發(fā)用于RNA m6A測序方法還是存在一些困難。首先,RNA不能直接擴增,必須首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。但m6A結(jié)構(gòu)不影響正常堿基配對,m6A位點信息可能在逆轉(zhuǎn)錄過程中丟失。其次,盡管m6A是真核mRNA中含量的修飾,但其含量非常低,并且在細胞中仍有大量的核糖體RNArRNA)和轉(zhuǎn)運RNAtRNA)干擾。因此,需要通過高度特異性的方法在復雜系統(tǒng)中富集m6A RNA。目前已經(jīng)開發(fā)出多種m6A的高通量測序技術(shù),促進了RNA修飾的功能研究。

1)抗體依賴性m6A測序方法

MeRIP-seq/m6A-seq 是使用m6A抗體開發(fā)的高通量測序技術(shù)。該技術(shù)通過mRNA片段化成100-200個核苷酸(nt),然后與m6A抗體孵育,洗脫的RNA用于構(gòu)建文庫和測序。甲基化區(qū)域在免疫沉淀RNA相對于input RNA的轉(zhuǎn)錄覆蓋率稱為peaks(圖1A)。MeRIP-seq/m6A-seq 生成了約200nt分辨率的m6A信息。MeRIP-seq/m6A-seq操作簡單,所有試劑均已商品化;因此,它一直是m6A測序的方法。

2021年有研究團隊開發(fā)了一種升級版的MeRIP-seq/m6A-seq方法,稱為m6A-seq2。m6A-seq2不是一次對一個樣本進行m6A免疫沉淀(m6A-IP),而是對合并RNA樣本進行m6A-IP。帶有條形碼的RNA接頭被連接到不同樣本的片段化RNA上,然后在合并樣本上執(zhí)行單個抗m6A-IP,然后根據(jù)條形碼序列分配原始樣本的reads(圖1A)。m6A-seq2所有m6A-IP都在單管中進行,可以減少技術(shù)變異性、樣本起始量和文庫制備成本。此外,考慮到不同樣本之間對固定數(shù)量抗體的競爭,m6A-seq2可能能夠?qū)崿F(xiàn)不同樣本之間m6A整體水平的比較。

m6A單堿基分辨率交聯(lián)和免疫沉淀方法(m6A-CLIP/miCLIP)可以成功生成單堿基分辨率的m6A位點信息。該方法片段化的RNAm6A抗體孵育,然后RNA-抗體復合物通過254 nm UV光交聯(lián),通過蛋白酶消化得到的氨基酸殘基抑制逆轉(zhuǎn)錄中的堿基配對,導致在m6A位點附近發(fā)生片段化或突變,最終以單堿基分辨率獲得m6A位點信息(圖1A)??贵w和RNA的結(jié)合效率以及交聯(lián)效率將對最終的測序結(jié)果產(chǎn)生重大影響。此外,交聯(lián)主要發(fā)生在抗體的芳香族氨基酸和RNA的嘧啶堿基之間。因此,m6A-CLIP/miCLIP不是直接鑒定單m6A位點,而是從相鄰嘧啶位點突變中進行推斷;無法準確定位多個相鄰腺苷中的m6A,且很難對群集m6A分布進行分析。

image.png

1:高通量m6A測序技術(shù)

A. 基于抗體的m6A測序方法示意圖:MeRIP-seq/m6A-seq、m6A-seq2m6A-CLIP/miCLIP

B. 抗體非依賴性m6A測序方法示意圖:m6A SEAL-seq、m6A SAC-seq、Nanopore Direct RNA-seqGLORI-seq。

 

 

 

2)抗體非依賴性測序技術(shù)

基于抗體的m6A高通量測序技術(shù)存在明顯的缺點:m6A抗體質(zhì)量不易控制,使用不同制造商的抗體獲得結(jié)果差異較大。此外,抗體的高價格和測序所需的大量RNA也阻礙其大規(guī)模應用。為了克服這些局限,科研人員也提出了多種抗體非依賴性m6A高通量測序方法。

FTO輔助的m6A選擇性化學標記方法(m6A-SEAL-seq)利用去甲基化酶FT的特性,在體外對m6A進行標記。FTO用于將m6A氧化為中間產(chǎn)物hm6A,hm6A進一步與二硫蘇糖醇(DTT)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的N6-二硫代硫醇甲基腺苷(dm6A)。然后用生物素標記dm6A以富集含有原始m6ARNA片段。對富集的RNA進行測序以獲得m6A位點信息(圖1B)。m6A-SEAL-seq所需初始RNA量很低,FTO具有很強大的去甲基化活性,幾乎沒有序列選擇性。m6A-SEAL-seq的缺點是操作步驟多、耗時長、分辨率與MeRIP-seq相似。

選擇性丙烯基化學標記測序(m6A-SAC-seq)可以直接標記m6A,覆蓋幾乎所有m6A經(jīng)典motif,并以單堿基分辨率定量分析捕獲的m6A位點。該方法使用特定酶將烯丙基化學基團添加到m6A中,形成a6m6A,經(jīng)I2處理后進行環(huán)化。在逆轉(zhuǎn)錄過程中,環(huán)化的a6m6A被逆轉(zhuǎn)錄酶讀為突變?;谕蛔兾稽c檢測轉(zhuǎn)錄組中的m6A位點,并通過標準曲線轉(zhuǎn)換突變率來獲得m6A含量的準確信息(圖1B)。m6A-SAC-seq可廣泛應用于各種生物學背景,并在基礎(chǔ)生物學研究和臨床應用中具有良好前景。m6A-SAC-seq的主要局限在于反應基于酶,因此可能具有序列偏好。

納米孔直接RNA測序(Nanopore Direct RNA-seq)是另一種能夠以單堿基分辨率鑒定m6A修飾的測序技術(shù)。當RNA通過納米孔時,通過納米孔表面的電場強度鑒定RNA序列。RNA修飾導致強度水平變化,因此可以通過以單堿基分辨率計算確定修飾堿基(圖1B)。盡管Nanopore Direct RNA-seq能夠在單堿基水平上鑒定m6A修飾,但仍存在一些缺點,如成本高、準確性低、對RNA質(zhì)量和初始量要求較高。

乙二醛和亞硝酸鹽介導的未甲基化腺苷脫氨酶測序(GLORI-seq)是最近報道的技術(shù);它能夠高效且無偏倚檢測單堿基m6A位點,并定量m6A修飾水平。GLORI技術(shù)使用乙二醛和亞硝酸鹽的催化系統(tǒng)高效地將未甲基化腺苷脫氨形成肌苷(AI>98%)。肌苷在逆轉(zhuǎn)錄過程中與胞嘧啶匹配,隨后在測序過程中被讀為鳥苷(G),產(chǎn)生A-to-G轉(zhuǎn)化。而m6A保持不變,在測序后仍被讀為A。因此,GLORI通過檢測測序readsA的比例,實現(xiàn)了對單堿基m6A的定量(圖1B)。

 

單基因m6A位點的檢測

盡管高通量測序技術(shù)能夠快速獲得數(shù)千個m6A位點數(shù)據(jù),但由于測序過程中的偏倚或技術(shù)原理上的缺陷,它們?nèi)匀粫a(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。因此,有必要開發(fā)檢測單基因m6A位點的方法。

MeRIP-qRT-PCR已被廣泛用于驗證高通量測序鑒定的m6A peaks。mRNA或總RNA被片段化為100-200nt,隨后用m6A抗體進行免疫沉淀,富集的RNA通過常規(guī)qRT-PCR進行定量(圖2)。盡管MeRIP-qRT-PCR簡單實用,但它不能提供單堿基分辨率,并且依賴于m6A抗體的特異性。

基于單堿基延伸和連接的qPCR擴增方法(SELECT)利用m6A抑制DNA聚合酶和連接酶的特性,方便快速地檢測特定位點的m6A修飾及程度。SELECT使用DNA聚合酶和連接酶連接靶位點的兩個互補DNA引物。在這個過程中,m6A首先干擾上游引物的延伸,然后阻礙下游引物的連接。盡管m6A不會抑制每一步,但通過兩步反應可以大幅減少最終產(chǎn)物量。最終,通過qRT-PCR分析目標位點和對照組的閾值循環(huán)(Ct)的差異,可以檢測目標位點的m6A修飾和甲基化程度(圖2)。SELECT操作簡便,所有實驗都可以在一個反應系統(tǒng)中完成,無需額外的純化步驟。但SELECT需要引入對照組并生成標準曲線以完成檢測和定量分析

位點特異性切割和放射性標記,隨后通過連接輔助提取和TLCSCARLET)可以以單堿基分辨率定量檢測RNA中的修飾位點,這目前是RNA修飾的“金標準”。因為RNase H會消化RNA/DNA雜交體中的RNA,但不消化RNA/2-O-甲基化DNA雜交體中的RNA,使用RNase H暴露于預定義的m6A位點進行放射性標記。使用DNA連接酶將32P標記的RNA片段連接到116個核苷酸的單鏈DNA寡核苷酸上。然后用RNase T1/A處理樣品以消化所有RNA,而32P標記的預定義m6A位點保持不變。經(jīng)過凝膠純化和核酸酶P1消化后,通過TLC確定m6A修飾狀態(tài)(圖2)。SCARLET技術(shù)的應用受到其復雜步驟、長實驗時間和使用放射性試劑的限制。

image.png

2:單基因m6A位點檢測方法

位點特異性m6A檢測方法示意圖:MeRIP-qRT-PCRSELECTSCARLET

 

 

總結(jié)而言,目前已經(jīng)開發(fā)出的不同層面m6A修飾檢測方法主要有:

1)整體水平檢測:TLC、Dot-blotLC-MS/MS

2)轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)m6A修飾高通量檢測(圖1):

a)基于特異性抗體的測序技術(shù)(MeRIP-seq/m6A-seq、m6A-seq2、m6A-CLIP/miCLIP);

b)非抗體依賴的測序技術(shù)(m6A-SEAL-seq、m6A-SAC-Seq、Nanopore Direct RNA SeqGLORI-Seq);

3)單基因m6A位點檢測技術(shù)MeRIP-qRT-PCR、SELECT、SCARLET(圖2)。

 

以上方法有不同的應用場景,科研老師們可以根據(jù)自己的科研需求選擇適合的檢測方法。

 

參考文獻:

Tang J, Chen S, Jia G. Detection, regulation, and functions of RNA N6-methyladenosine modification in plants. Plant Commun. 2023 May 8;4(3):100546. pii: S2590-3462(23)00044-5. doi: 10.1016/j.xplc.2023.100546. PubMed PMID: 36627844.

免責聲明

  • 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責任。
  • 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負責,不承擔此類作品侵權(quán)行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時,必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負版權(quán)等法律責任。
  • 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
企業(yè)未開通此功能
詳詢客服 : 0571-87858618
日本中文字幕永久在线人妻蜜臀-欧美一区二区的网站在线观看| 欧美一区二区三区调教视频-三上悠亚国产精品一区二区三区| 婷婷人妻少妇激情在线-欧美日韩人体艺术一区二区| 国产在线观看高清精品-四季av一区二区三区中文字幕| 性激烈欧美三级在线播放-久久中文字幕人妻少妇| 亚洲精品激情一区二区-久久成人国产欧美精品一区二区| 日韩二级视频在线观看-美女扒开奶罩露出奶子的视频网站| 亚洲综合av一区二区三区-高潮又爽又黄无遮挡激情视频| 亚洲国产精品日韩欧美-国产又粗又硬又大爽黄| 国产欧美成人精品第一区-日本黄色精品一区二区| 日本女优一卡二卡在线观看-欧美大胆a级视频秒播| 亚洲美女喘息呻吟的网站-国产免费一区二区三区三洲| 精品少妇一区二区18-一区二区三区日韩在线播放| 亚洲欧洲成视频免费观看-国产福利一区二区在线观看| 成人av一区二区蜜桃-亚洲色图激情人妻欧美| 亚洲av日韩五月天久热精品-国产日韩欧美一区二区三区群战| 日本亚洲精品中字幕日产2020-很黄很黄的裸交视频网站| 看肥婆女人黄色儿逼视频-秋霞电影一区二区三区四区| 人妻少妇无乱码中文字幕-人成免费视频一区二区| 白嫩美女娇喘呻吟高潮-久久一区二区三区日产精品| 交换朋友的妻子中文字幕-日本美女8x8x8x8| 一区二区三区国产高清mm-美女张开腿让帅哥桶爽| 国产精品美女在线网址-久草免费福利在线观看视频| 亚洲中文一二三av网-亚洲天堂成人免费在线| 日本韩国亚洲欧美三级-日本东京不卡网一区二区三区| 亚洲一区二区免费av-中文字幕人妻久久久一区二区三区| 激情字幕久久久字幕中文-一区二区三区免费黄片| 国产精品中出久久久蜜臀-久久久中国精品视频久久久| 久久夜色精品亚洲噜国产av-大香蕉伊人猫咪在线观看| 国产一区二区无套内射-国内精品久久久久久久齐pp| 人妻互换精品一区二区-夜夜爽一区二区三区视频| 亚洲欧洲一区二区福利-亚洲欧美日韩高清中文| 亚洲视频一区二区三区免费-国产一级黄色大片在线| 亚洲av综合av一区东京热-黄页免费视频网站在线观看| 欧美日本亚一级二级三区久久精品-日韩欧美一区二区久久婷婷| 久久蜜桃精品一区二区-麻豆视频啊啊啊好舒服| 国产精品一区二区欧美视频-国产一区二区三区天码| 国产成人精品免费视频大全办公室-亚洲欧美日本综合在线| 国产亚洲欧美一区91-亚洲欧美一区二区在线| 成人免费资源在线观看-欧美国产日韩高清在线综合| 熟女熟妇伦51788-国产av在线播放一区二区三区|