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Taq DNA聚合酶在PCR技術(shù)中的應(yīng)用及優(yōu)化策略

來(lái)源:蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司   2024年08月30日 10:11  

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種在生物分子領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)。Taq DNA聚合酶作為PCR反應(yīng)中的關(guān)鍵酶,其性能直接影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本文主要介紹了Taq DNA聚合酶的來(lái)源、特性、活性定義及質(zhì)量控制方法,并探討了Taq DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中的使用方法及優(yōu)化策略。

一、Taq DNA聚合酶的來(lái)源與特性

Taq DNA聚合酶是一種來(lái)源于嗜熱菌Thermus aquaticus的耐熱性DNA聚合酶,通過(guò)大腸桿菌重組表達(dá)純化獲得。該酶分子量為94kDa,與天然Taq DNA聚合酶具有相同的功能。Taq DNA聚合酶具有5'3'聚合酶活性和5'3'外切酶活性,但無(wú)3'5'外切酶活性。這使得PCR產(chǎn)物的3'端帶有突出的A堿基,便于克隆至T載體。

DNA聚合酶規(guī)格.jpg


二、Taq DNA聚合酶的活性定義及質(zhì)量控制

1. 活性定義:1個(gè)活性單位(U)定義為在74℃下,30分鐘內(nèi)催化10 nmol dNTP摻入酸不溶物所需的酶量。

2. 質(zhì)量控制:Taq DNA聚合酶的蛋白純度通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè),純度不低于95%。此外,還需進(jìn)行以下檢測(cè):

1)核酸內(nèi)切酶活性檢測(cè):將5 U Taq DNA Polymerase200 ng超螺旋質(zhì)粒DNA37℃下共同溫育4小時(shí),使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),少于10%的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)變成缺刻或線性狀態(tài)。

2)非特異性核酸酶活性檢測(cè):將5 U Taq DNA Polymerase15 ng雙鏈DNA片段在37℃溫育16小時(shí),使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)雙鏈DNA底物無(wú)變化。

3)宿主DNA殘留檢測(cè):使用大腸桿菌16S rDNA特異性引物探針組,采用熒光定量PCR法檢測(cè)5 U Taq DNA Polymerase,大腸桿菌宿主基因組DNA殘留低于1 copy。

 

三、Taq DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中的使用方法及優(yōu)化策略

 

Taq DNA Polymerase-e15109s(1)(1).png


1. 使用方法:

1)建議的PCR反應(yīng)體系:以50 μl體系為例,Taq DNA Polymerase5 U/μl0.25 μl,10×Taq Reaction Buffer 5 μl,dNTP10 mM1 μl,正向引物(10 μM1 μl,反向引物(10 μM1 μl,模板DNA x μl,ddH2O補(bǔ)至50 μl

2)常規(guī)PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性943~5分鐘,變性9430秒,退火55~6530秒,延伸7230~60/kb,終延伸725分鐘。

 

DNA聚合酶使用.jpg


2. 優(yōu)化策略:

1)引物設(shè)計(jì):引物長(zhǎng)度建議設(shè)定為18~25 bp,GC含量為40%~60%。引物終濃度推薦為0.2 μM,效果不佳時(shí)可以在0.1~1 μM進(jìn)行調(diào)整。

2)模板濃度:不同模板最佳反應(yīng)濃度有所不同。以基因組DNA為模板時(shí),一般使用量應(yīng)在10~400 ng;當(dāng)模板為質(zhì)?;虿《?/span>DNA時(shí),一般使用量應(yīng)在10 pg~20 ng。

3)預(yù)變性條件:對(duì)于一些復(fù)雜模板,如菌液、菌落(尤其是酵母)的PCR擴(kuò)增,預(yù)變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)至10分鐘,以提高預(yù)變性效果。

4)目的片段長(zhǎng)度:使用酵母菌液作為PCR擴(kuò)增模板時(shí),建議目的片段長(zhǎng)度不超過(guò)2.5 kb;若超出2.5 kb,建議將酵母菌液預(yù)先進(jìn)處理。

 

百時(shí)美的 Taq DNA Polymerase為來(lái)源于嗜熱菌Thermus aquaticus,經(jīng)大腸桿菌重組表達(dá)純化獲得的耐熱性DNA聚合酶,分子量為 94 kDa,與天然Taq DNA 聚合酶具有相同的功能。該酶具有 5'→ 3' 聚 合酶活性和 5'→3' 外切酶活性,但無(wú)3'→ 5'外切酶活性。PCR 產(chǎn)物的3' 端帶有突出的 A 堿基,可克隆至 T 載體。

 

總之,Taq DNA聚合酶在PCR技術(shù)中具有重要作用。通過(guò)了解其特性、活性定義及質(zhì)量控制方法,合理優(yōu)化PCR反應(yīng)體系及程序,可以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在實(shí)際應(yīng)用中,根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求,對(duì)Taq DNA聚合酶進(jìn)行優(yōu)化,有助于提高PCR技術(shù)的應(yīng)用效果。

蘇州阿爾法生物作為百時(shí)生物的聯(lián)盟供應(yīng)商提供實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備,實(shí)驗(yàn)耗材,生物試劑的一站式服務(wù),所提供的分子生物學(xué)試劑主要包括:限制性內(nèi)切酶AgeI、BamHIBsaI、EcoRIHindIII80多種,taq聚合酶,逆轉(zhuǎn)試劑盒,熒光定量試劑、體外轉(zhuǎn)錄酶等。

 

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