一、耐熱大腸菌群情況簡(jiǎn)要介紹

  耐熱大腸菌群的定義：用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分開，在44.5℃仍能生長(zhǎng)的大腸菌群，稱為耐熱大腸菌群。

  通常情況下，耐熱大腸菌群與大腸菌群相比，在人和動(dòng)物糞便中所占的比例較大，而且由于在自然界容易死亡等原因，耐熱大腸菌群的存在可認(rèn)為食品直接或間接的受到了比較近期的糞便污染。因而，耐熱大腸菌群在食品中的檢出，與大腸菌群相比，說明食品受到了更為不清潔的加工，腸道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。

二、參考標(biāo)準(zhǔn)

  《GBT5750.12-2006生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)：耐熱大腸菌群》 點(diǎn)擊下載

三、檢驗(yàn)方法以及結(jié)果分析

  3.1多管發(fā)酵法

  根據(jù)耐熱大腸菌群具有的生物特性，在44.5℃培養(yǎng)24 h能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)氣的特點(diǎn)，將不同量的水樣接種到含乳糖的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)陽性反應(yīng)結(jié)果可測(cè)出原水樣中耐熱大腸菌群的最可能數(shù)（MPN）。

  3.1.1 檢驗(yàn)步驟

  3.1.1.1 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)

  （1）取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，取1mL水樣接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，另取1mL水樣注入到9mL滅菌生理鹽水中，混勻后吸取1mL（即0.1mL水樣）注入到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每一稀釋度接種5管。

  對(duì)已處理過的出廠自來水，需經(jīng)常檢驗(yàn)或每天檢驗(yàn)一次的，可直接種5份10mL水樣雙料培養(yǎng)基，每份接種10mL水樣。

  檢驗(yàn)水源水時(shí)，如污染較嚴(yán)重，應(yīng)加大稀釋度，可接種1、0.1、0.01mL甚至0.1、0.01、0.001mL，每個(gè)稀釋度接種5管，每個(gè)水樣共接種15管。接種1mL以下水樣時(shí)，必須作10倍遞增稀釋后，取1mL接種，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌刻度吸管。

  （2）將接種管置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h±2 h。

圖1 耐熱大腸菌群在乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中生長(zhǎng)特征

  （3）從陽性管（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）中取1滴轉(zhuǎn)種于EC培養(yǎng)基中，置44.5℃水浴箱或隔水式恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（水浴箱的水面應(yīng)高于試管中培養(yǎng)基液面），培養(yǎng)24h±2h，如所有管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為陰性。

圖2 耐熱大腸菌群在EC培養(yǎng)基中生長(zhǎng)特征

  如有產(chǎn)氣者，則轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置44.5℃培養(yǎng)18 h～24 h觀察菌落形態(tài)。凡平板上有以下典型菌落者，則證實(shí)為耐熱大腸菌群陽性：

  深紫黑色、具有金屬光澤的菌落；

  紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；

  淡紫紅色、中心較深的菌落。

圖3 耐熱大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)特征

  （4）如檢測(cè)未經(jīng)氯化消毒的水，且只想檢測(cè)耐熱大腸菌群時(shí)，或調(diào)查水源水的耐熱大腸菌群污染時(shí)，可用直接多管耐熱大腸菌群方法，即在第一步乳糖發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)按照步驟（1）接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液在44.5℃±0.5℃水浴中培養(yǎng)，以下步驟同步驟（3）。

  3.1.2 結(jié)果報(bào)告

  根據(jù)證實(shí)為耐熱大腸菌群的陽性管數(shù)，查本標(biāo)準(zhǔn)中總大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表，報(bào)告每100 mL水樣中耐熱大腸菌群的最可能數(shù)（MPN）值。

表1 耐熱大腸菌群（MPN）檢索表（部分）

（總接種量55.5mL，其中5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣）

  3.2濾膜法

  耐熱大腸菌群濾膜法是指用孔徑為0.45μm的濾膜過濾水樣，細(xì)菌被阻留在膜上，將濾膜貼在加乳糖的選擇性培養(yǎng)基上，44.5℃培養(yǎng)24h能形成特征性菌落以此來檢測(cè)水中耐熱大腸菌群的方法。

  3.2.1 檢驗(yàn)步驟

  （1）準(zhǔn)備工作

  濾膜滅菌：將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2次～3次，以除去殘留溶劑。

  濾器滅菌：用點(diǎn)燃的酒精棉球火焰滅菌。也可用蒸汽滅菌器103.43kPa（121℃）高壓滅菌20min。

  （2）過濾水樣

  用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將100mL水樣（如水樣含菌數(shù)較多，可減少過濾水樣量，或?qū)⑺畼酉♂專┳⑷霝V器中，打開濾器閥門，在-5.07×10⁴Pa（負(fù)0.5大氣壓）下抽濾。

  （3）培養(yǎng)

  水樣濾完后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在MFC培養(yǎng)基上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基wan全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h±2h。如使用恒溫水浴，則需用塑料平皿，將皿蓋緊，或用防水膠帶貼封每個(gè)平皿，將培養(yǎng)皿成疊封入塑料袋內(nèi)，浸到44.5℃恒溫水浴里，培養(yǎng)24h±2h。耐熱大腸菌群在此培養(yǎng)基上菌落為藍(lán)色，非耐熱大腸菌群菌落為灰色至奶油色。

圖4 耐熱大腸菌群在MFC培養(yǎng)基上的菌落特征

  （4）對(duì)可疑菌落轉(zhuǎn)種EC培養(yǎng)基，44.5℃培養(yǎng)24h±2h，如產(chǎn)氣則證實(shí)為耐熱大腸菌群。

  3.2.2 結(jié)果報(bào)告

  計(jì)數(shù)被證實(shí)的耐熱大腸菌落數(shù)，水中耐熱大腸菌群數(shù)系以100mL水樣中耐熱大腸菌群菌落形成單位（CFU）表示，見下列公式：

  耐熱大腸菌菌落數(shù)（CFU/100mL）=所計(jì)得的耐熱大腸菌菌落數(shù)×100過濾水樣體積 

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