一、摘要：

1型糖尿病是一種會(huì)導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞破壞的自身免疫性疾病，需要終身胰島素治療。胰島移植提供了一個(gè)很有前途的解決方案，但也面臨著諸如可用性有限和需要免疫抑制等挑戰(zhàn)。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）為功能性β細(xì)胞提供了一個(gè)潛在的替代來源，并具有大規(guī)模生產(chǎn)的能力。然而，目前的分化方案，主要是在混合或2D環(huán)境中進(jìn)行的，缺乏可延展性和懸浮培養(yǎng)的理想條件。

我們研究了一系列可能影響分化過程的生物反應(yīng)器放大過程參數(shù)。該研究采用了一種優(yōu)化的HD-DoE協(xié)議，該協(xié)議設(shè)計(jì)具有可擴(kuò)展性，并在0.5L（PBS-0.5 Mini）垂直輪式生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)。

我們開發(fā)了一種三階段的懸浮生長過程，從貼壁培養(yǎng)過渡到懸浮培養(yǎng)，TB2培養(yǎng)基在規(guī)?；^程中支持iPSC的生長。階段性優(yōu)化方法和延長分化時(shí)間用于增強(qiáng)iPSC衍生的胰島樣簇的標(biāo)記物表達(dá)和成熟。連續(xù)的生物反應(yīng)器運(yùn)行被用于研究營養(yǎng)和生長的限制以及對分化的影響。將連續(xù)生物反應(yīng)器與對照培養(yǎng)基變化生物反應(yīng)器進(jìn)行比較，顯示出代謝變化和更類似b細(xì)胞的分化譜。從試驗(yàn)中收集的低溫保存的聚集物被恢復(fù)，恢復(fù)后顯示出活力和胰島素分泌能力得到維持，這表明它們具有存儲(chǔ)和未來移植治療的潛力。

本研究表明，階段時(shí)間的增加或限制培養(yǎng)基補(bǔ)充以減少乳酸積累可以增加在大規(guī)模懸浮環(huán)境中培養(yǎng)的胰島素合成細(xì)胞的分化能力。

二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容節(jié)選：營養(yǎng)消耗和代謝物的分析

       為了檢測細(xì)胞潛在的替代碳源和氮源，我們分析了對照組和連續(xù)生物反應(yīng)器在整個(gè)培養(yǎng)過程中的氨基酸代謝（圖S5A-B）。使用快速培養(yǎng)基氨基酸維生素分析儀Rebel（908 Devices）來分析氨基酸濃度。必需氨基酸，如組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸在整個(gè)培養(yǎng)期間都保持不變。然而，一些氨基酸在兩種培養(yǎng)基中都全部耗盡，包括5天后的L-天冬氨酸和16天后的L-谷氨酸。氨基酸代謝對正常的胰腺β細(xì)胞功能至關(guān)重要，丙氨酸和谷氨酰胺以其調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能和胰島素分泌的作用而聞名。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，谷氨酰胺和丙氨酸的濃度高于新鮮培養(yǎng)基，表明它們不限制生長（圖S5A-B）。然而，它們增加的來源仍然未知，不像之前的觀察而將它們的增加歸因于GlutaMAX™添加劑。與起始培養(yǎng)基相比，丙氨酸和谷氨酰胺水平的升高在對照組生物反應(yīng)器中沒有觀察到，后者在不同階段之間和整個(gè)延長的內(nèi)分泌誘導(dǎo)階段都有頻繁的培養(yǎng)基變化。兩種生物反應(yīng)器之間無其他顯著性差異。如前所述，限制培養(yǎng)基補(bǔ)充的生物反應(yīng)器比對照培養(yǎng)基變化的生物反應(yīng)器具有更好的分化能力。氨基酸濃度調(diào)節(jié)和血清缺乏與促進(jìn)來自人類干細(xì)胞的胰腺β細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)。

       此外，使用FLEX2（Nova Biomedical）對兩種培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行評估，分析兩種反應(yīng)器的整個(gè)培養(yǎng)期間Gln、Glu、NH4+、Na+、K+、Ca++、pH、PCO2和PO2（圖S6A-B）。在連續(xù)生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)基的滲透壓穩(wěn)定增加，但保持在280-320mOsm/kg范圍內(nèi)。這種增加可以歸因于由營養(yǎng)物質(zhì)代謝和其他廢物產(chǎn)生的溶質(zhì)的積累。相比之下，對照培養(yǎng)基的滲透壓變化的生物反應(yīng)器隨著培養(yǎng)基在細(xì)胞分化過程的不同階段被補(bǔ)充而波動(dòng)。谷氨酰胺和谷氨酸水平也進(jìn)行了評估，兩者都顯示隨著時(shí)間的推移而消耗。這與使用Rebel分析儀進(jìn)行的測量結(jié)果一致。兩種生物反應(yīng)器在生物分化上具有可比性，除了在連續(xù)生物反應(yīng)器中pH的持續(xù)下降和預(yù)期的耗氧速率方面的主要差異。在反應(yīng)液中測量的氣體可能會(huì)受到收集和測量之間時(shí)間的影響，但是，對所有樣品的總體影響是相同的。總體數(shù)據(jù)顯示，在培養(yǎng)10天或PP誘導(dǎo)分化階段后，PO2水平開始穩(wěn)步下降。盡管反應(yīng)液與兩個(gè)生物反應(yīng)器頂空內(nèi)的氣體體積相同(500毫升），但與控制培養(yǎng)基補(bǔ)充變化生物反應(yīng)器相比，進(jìn)入反應(yīng)液的氧氣通量可能不足以補(bǔ)充0.5L連續(xù)容器中增加的耗氧量。