隨著科學(xué)研究向著更精細(xì)、更微觀的方向發(fā)展，對成像技術(shù)的要求也日益提高。傳統(tǒng)的光學(xué)成像技術(shù)可以提供200nm左右的分辨率，不能滿足細(xì)胞器，以及分子水平上的研究。法國abbelight公司基于新興單分子定位顯微成像（SMLM）技術(shù)推出了3D單分子熒光成像系統(tǒng)-SAFe 360，能夠提高定位精度，xyz三軸定位度高達(dá)15 nm，支持同時四色成像，可以用于細(xì)胞納米三維成像，觀測高清晰亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，實時研究不同結(jié)構(gòu)功能蛋白的共定位信息，以及在單分子水平研究分子動力學(xué)反應(yīng)和細(xì)胞間的相互作用等。設(shè)備一經(jīng)推出，已在Nature Nanotechnology、Science Advances 、BioRxiv等SCI期刊發(fā)表近40余篇文章。本文我們將概述3D單分子熒光成像系統(tǒng)表征納米受體和納米顆粒助力癌癥研究領(lǐng)域的Nature子刊文章。

3D單分子熒光成像系統(tǒng)-SAFe 360

一、Nature Nano:納米受體降解突變p53蛋白，助力癌癥研究

腫瘤抑制因子p53在細(xì)胞中扮演著關(guān)鍵的角色，由TP53 基因編碼，參與細(xì)胞的生長、修復(fù)及凋亡等過程的調(diào)控。超過50%的人類癌癥中存在TP53突變，乳腺癌和卵巢癌中比例更高，與野生型（WT）p53相比，錯義突變p53（mutp53）會穩(wěn)定在細(xì)胞中積累到高水平，mutp53不僅失去了WTp53的功能，還獲得了致癌功能，導(dǎo)致增強(qiáng)的腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和對治療的抵抗。因此靶向mutp53的增強(qiáng)功能成為一種有效的治療策略，但是缺乏特異性自噬受體限制了這種治療策略。

華南理工大學(xué)張云嬌，楊顯珠和南方醫(yī)科大學(xué)溫龍平團(tuán)隊開發(fā)了仿生納米受體（NR），使用3D單分子熒光成像系統(tǒng)表征相關(guān)納米受體，研究受體模擬選擇性自噬受體的功能，能夠結(jié)合mutp53蛋白，提高自噬小體的形成水平，增加對突變型 mutp53的降解效率。該研究以 “Nanoreceptors promote mutant p53 protein degradation by mimicking selective autophagy receptors”為題。發(fā)表于《Nature Nanotechnology》上。

研究者通過3D單分子熒光成像系統(tǒng)，通過隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)技術(shù)（STORM），提供20 nm的超高分辨率，成功表征了NR中納米顆粒NPs，MBP以及不同mutp53蛋白在NR中分布，標(biāo)尺為100 nm，可視化展示了MBP介導(dǎo)的p53與NR表面的結(jié)合過程?？梢杂^察到MBP（綠色）環(huán)繞著納米粒子核心（紅色），證明了MBP成功地共軛到納米粒子表面。此外，當(dāng)包括S241F、R175H、R248W、R280W和野生型p53在內(nèi)的p53蛋白加入NR溶液時，各種mutp53蛋白（藍(lán)色）主要位于NR的外部表面，而野生型p53的共定位較少。

比較含有不同量DOTAP的NRs，發(fā)現(xiàn)增加DOTAP含量能夠提升在表達(dá)p53-S241F突變的卵巢癌細(xì)胞系ES-2中mutp53的清除效果，但是可能DOTAP的正電荷原因，隨著DOTAP的增加，NRs的毒性也隨之增加。對比后發(fā)現(xiàn)，20% DOTAP的NRs能夠引發(fā)足夠的自噬誘導(dǎo)作用，且其毒性可忽略不計，作為后續(xù)實驗的最佳配方。

免疫熒光和Western Blot證實研究證明NRs能有效降解mutp53，而mNRs、dNRs或自由MBP肽則不能，這一點通過。NRs和dNRs能增加LC3-II水平，反映出自噬的增加，而dNRs未能降解mutp533。此外，自由DOTAP或mNRs與自由DOTAP的組合也未能降解mutp53。上述結(jié)果表明，需要在同一載體上同時存在MBP和DOTAP才能降解mutp53。

為了進(jìn)一步評估NRs在臨床上的潛在應(yīng)用，研究者建立了p53突變（P72R+/+、C141Y+/+和L350P+/?）的患者來源的卵巢癌移植模型，小鼠在相同的13天治療方案下分別注射PBS、CDDP、NRs或NRs-Pt。NRs有效抑制了腫瘤生長，而NRs-Pt在抑制腫瘤體積和重量方面展示出進(jìn)一步增強(qiáng)的效果。重要的是，NRs-Pt和NRs在較小程度上增強(qiáng)了自噬作用，在腫瘤組織中減少了mutp53并增加了細(xì)胞凋亡。

【參考文獻(xiàn)】

[1]. Huang, Xiaowan, et al. "Nanoreceptors promote mutant p53 protein degradation by mimicking selective autophagy receptors." Nature Nanotechnology 19.4 (2024): 545-553.

二、Nature Com：納米顆粒特異性抗體協(xié)同調(diào)控NK細(xì)胞和T細(xì)胞實現(xiàn)抗腫瘤免疫

NK細(xì)胞和T細(xì)胞對于先天免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)至關(guān)重要，并在腫瘤識別和清除中發(fā)揮互補(bǔ)且協(xié)調(diào)的作用。近期研究表明，靶向在NK細(xì)胞和T細(xì)胞上共表達(dá)的檢查點分子，如TIGIT和NKG2A可以引發(fā)同步的先天和適應(yīng)性免疫。然而，使用相應(yīng)的單克隆抗體（mAbs）進(jìn)行的單一療法在臨床試驗中未能達(dá)到預(yù)期效果，這歸因于腫瘤發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，突顯了將mAbs與其他檢查點抑制劑結(jié)合的必要性。

近日，華南理工大學(xué)沈松，王均團(tuán)隊開發(fā)了一種三特異性納米抗體（Tri-NAb），并且使用3D單分子熒光成像系統(tǒng)表征這些納米顆粒以及對應(yīng)抗體的位置，研究Tri-NAb通過協(xié)調(diào)NK細(xì)胞和T細(xì)胞在體外和體內(nèi)顯示出顯著的抗腫瘤效果，體現(xiàn)了其協(xié)同NK細(xì)胞和T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化潛力。 該成果以“Orchestrating NK and T cells via tri-specific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity”為題，發(fā)表于《Nature Communications》上。

研究者首先通過多變量篩選設(shè)計了一種具有最佳配方的生物相容性白蛋白/聚酯復(fù)合納米顆粒（APCN），再將αPDL1/α4-1BB/αNKG2A固定在預(yù)先組裝了αFc的APCN上得到Tri-Nab，Tri-Nab積聚在腫瘤中，有效觸發(fā)NK細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞的激活（①）和增殖（②），增強(qiáng)它們與腫瘤細(xì)胞的相互作用（③），從而刺激細(xì)胞毒性顆粒的釋放（④）。這種協(xié)調(diào)的相互作用引發(fā)了高效的腫瘤細(xì)胞凋亡（⑤）。

為了確認(rèn)Tri-Nab的合成，研究者利用ELISA、電鏡和3D單分子熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行表征，其中3D單分子熒光成像系統(tǒng)表征了納米顆粒。熒光光譜顯示，加入聚L-丙交酯PLLA后，HSA的內(nèi)在熒光信號顯著減弱，表明PLLA可能改變了圍繞發(fā)光分子的疏水環(huán)境，用羅丹明B（PLLA）和iFluor™ 488（HSA）標(biāo)記后，超分辨圖像顯示了PLLA和HSA在APCNs內(nèi)準(zhǔn)確的共定位的情況。

為驗證治療性抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力，ELISA和流式分別證明了Tri-NAb的親和力和游離的αPDL1、α4-1BB和αNKG2A無異，而且Tri-Nab可以粘附在PDL1，4-1BB和NKG2A表達(dá)的細(xì)胞上，且Tri-Nab單克隆抗體靶向結(jié)合的可能性很高。細(xì)胞實驗中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NPαPDL1+α4-1BB和Tri-NAb處理組中CD8+ T細(xì)胞（綠色）與MC38腫瘤細(xì)胞（紅色）之間的相互作用增強(qiáng)，而NPαPDL1+αNKG2A和Tri-NAb有效促進(jìn)了NK細(xì)胞（藍(lán)色）與腫瘤細(xì)胞的相互作用。

為了驗證Tri-Nab在體內(nèi)的效果，研究者在小鼠黑色素瘤模型中評估了Tri-NAb的治療效果。與IgG對照組和Tri-mAbs相比，治療NPαPDL1+α4-1BB、NPαPDL1+αNKG2A或NPα4-1BB+αNKG2A顯示出在腫瘤控制方面的一些優(yōu)勢，而Tri-NAb表現(xiàn)出對腫瘤進(jìn)展的更強(qiáng)抑制作用（圖b、c）。在給藥三次后，流式結(jié)果展示了腫瘤組織中的免疫細(xì)胞浸潤情況。Tri-NAb處理組中的NK細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞的百分比和數(shù)量明顯高于其他治療組（圖d–i），這表明Tri-NAb有效激活了NK細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞，從而增強(qiáng)了抗腫瘤活性。此外，小鼠的生存時間顯著延長，9只小鼠中有2只實現(xiàn)了腫瘤消退（圖j），而在治療期間未觀察到小鼠體重或外周血炎癥細(xì)胞因子水平的顯著變化

綜上所述，本研究證明了同時靶向NK細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞的三特異性納米抗體的可行性和有效性，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。

【參考文獻(xiàn)】

[1]. Ye, Qian-Ni, et al. "Orchestrating NK and T cells via tri-specific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity." Nature Communications 15.1 (2024): 6211.