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文獻(xiàn)導(dǎo)讀| 影響納米顆粒跟蹤分析技術(shù)的關(guān)鍵參數(shù)——標(biāo)準(zhǔn)操作流程的建立

來源:瑞芯智造(深圳)科技有限公司   2024年09月26日 10:52  



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近年來,納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。外泌體、合成納米顆粒等已被廣泛應(yīng)用于疾病診斷,藥物遞送等方面。納米材料的尺寸和濃度對于診斷和治療效果具有十分重要的意義,納米粒子跟蹤分析(NTA)技術(shù)是一種常用的表征納米材料大小和濃度的方法,可以對納米材料進(jìn)行快速、精確的粒和濃度測量。然而,目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)的操作程序來保證測量的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。在NTA表征過程中,包括樣品濃度、相機設(shè)定參數(shù)、樣品流速等都會對測量結(jié)果造成影響。同時,樣品的分散度也會在一定程度上影響NTA的測量結(jié)果。因此,需要全面性地對上述多個參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)性分析,以便建立合適的NTA表征方法學(xué)。

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近日,中國科學(xué)院上海藥物研究所于International Journal of Pharmaceutics上發(fā)表題為“納米材料大小和濃度的關(guān)鍵參數(shù)以標(biāo)準(zhǔn)化納米顆粒跟蹤分析”的文章。該項研究中,作者系統(tǒng)性地評估了包括樣品構(gòu)成,樣品濃度,儀器設(shè)置參數(shù),相機設(shè)置參數(shù),液體流速對于NTA (NanoSight NS300) 測量準(zhǔn)確性的影響。在研究過程中,他們同時選取了顆粒粒徑表征的金標(biāo)準(zhǔn)——透射電子顯微鏡及基于電阻脈沖感應(yīng) (RPS) 原理的NanoCoulter納米庫爾特粒度分析儀進(jìn)行正交實驗,交叉驗證NTA對顆粒粒徑及濃度測量的精度。


影響因素的分析與SOP的建立
具體來說,作者系統(tǒng)性地評估了樣品濃度、相機曝光度、進(jìn)樣泵流速對NTA測試效果的影響。
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比較不同顆粒濃度下測量結(jié)果的準(zhǔn)確性

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圖1樣品濃度對NTA測量結(jié)果的影響。

作者使用了不同大小的聚苯乙烯 (PS) 和二氧化硅 (SiO2)標(biāo)準(zhǔn)顆粒,在不同的粒子濃度下進(jìn)行了測量,并比較了不同濃度下的平均尺寸和濃度偏差。結(jié)果顯示,當(dāng)粒子濃度在108-10particles/mL之間時,測量結(jié)果最為準(zhǔn)確,線性趨勢最好。此時對應(yīng)視野內(nèi)的顆粒數(shù)為10-100和400-6500個。


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比較不同曝光度對測量結(jié)果的影響

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圖片2. 曝光度對NTA測量結(jié)果的影響

與DLS不同,NTA通過相機追蹤顆粒的實時的布朗運動進(jìn)行顆粒粒徑計算。因此優(yōu)化相機設(shè)置參數(shù)可以顯著提高NTA測得的粒徑和濃度的準(zhǔn)確性。作者使用了混合的不同尺寸的PS顆粒,在不同的曝光度 (camera level) 下進(jìn)行了表征。曝光度是表明相機對顆粒運動敏感程度的參數(shù)。通過調(diào)節(jié)曝光度,可以影響NTA的拍照結(jié)果。結(jié)果顯示,在曝光度為6-9時,100 nm的PS顆粒觀測不佳,而200 nm的PS顆粒清晰可見,當(dāng)曝光度為10-14時,100 nm的PS顆??梢郧逦乇挥^測到,而200 nm的PS顆粒會過曝,影響結(jié)果。隨后作者進(jìn)一步評估了曝光度對100 nm,120 nm,150 nm,170 nm和200 nm的PS顆粒的粒徑峰值及分布進(jìn)行了表征。結(jié)果表明,曝光度變化并未顯著影響PS顆粒的粒徑峰值,但是隨著曝光度上升,各組PS顆粒的粒徑平均值上升。因此作者認(rèn)為具體的不同大小的顆粒會與曝光度共同影響粒徑的測量結(jié)果。當(dāng)樣本分散度較大時,NTA相機難以找到合適的曝光度以保證可以拍到所有顆粒。在撰寫相關(guān)報告的時候,需要將NTA的曝光度等設(shè)定參數(shù)一并提交,以保證數(shù)據(jù)透明性。


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比較不同不同泵速對測量結(jié)果的影響

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3. 泵流速對NTA測量結(jié)果的影響

之前的研究已經(jīng)表明,溶液粘度會影響NTA測量結(jié)果的準(zhǔn)確性,但是對于泵速對測量結(jié)果有何影響仍是未知,因此作者使用了不同大小的PS顆粒,在不同的泵速下進(jìn)行了測量,并比較了不同速度下的平均尺寸和濃度偏差。結(jié)果顯示,對于小于200 nm的顆粒,泵速在50 AU (arbitrary unit)以內(nèi)可以得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果,而對于更大的顆粒,則需要更低的泵速才能保證準(zhǔn)確性。


多分散樣本的分析


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4. NTA、DLS和RPS對多分散樣本的測量影響

隨后基于這些結(jié)果,作者按照該標(biāo)準(zhǔn)操作流程,評估了NTA對于多分散樣品的表征能力。作者制備了1: 1和10: 1(濃度比)的100 nm和150 nm PS顆?;旌衔铮鶕?jù)不同的曝光度,NTA在7-10的范圍內(nèi)對兩個樣品都可以順利測量得出兩個粒徑峰位。隨后,作者進(jìn)一步制備了1: 1: 1的100 nm,150 nm和200 nm及1: 1: 1: 1的100 nm,150 nm,170 nm和200 nm的三混合和四混合樣本,結(jié)果表明NTA無法完成測量,僅能得出一個寬峰。隨后作者進(jìn)一步使用DLS和RPS對上述四個樣本進(jìn)行分析,DLS對于上述四個樣本都無法測量得到精確峰位,僅能得到一個單峰,而基于RPS理論的NanoCoulter通過單顆粒檢測手段,成功地測量出混合物的粒徑,并得出精確峰位。隨后作者進(jìn)一步驗證了RPS的粒徑測量效果,制備了濃度比為1: 1: 1: 1的80 nm,120 nm,160 nm和200 nm的混合物。測量結(jié)果再次證實RPS可以順利地將混合物測出對應(yīng)的峰,并且不同的樣品峰之間區(qū)分明顯,分辨率良好。這種四分布樣品可以更真實的代表實際樣品。


生物學(xué)樣本的分析


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圖5. NTA、DLS、TEM和RPS對兩種生物學(xué)樣本的分析結(jié)果

最后,作者選取了兩種外泌體(分別來源于HEK293細(xì)胞和干姜),分別使用NTA,DLS和RPS技術(shù)進(jìn)行粒徑分析。結(jié)果表明在粒徑分析方面,NTA所得到的數(shù)據(jù)與TEM相似,而DLS粒徑值偏大,RPS所得粒徑結(jié)果偏小。在濃度方面,RPS表現(xiàn)出更精確的定量分析能力,這得益于RPS的單顆粒檢測技術(shù),可以對每一個顆粒實現(xiàn)精確表征。


通過對實際樣品的測量,作者歸納總結(jié)了四種不同的顆粒表征方法的特點(表1)。作者認(rèn)為NTA在顆粒粒徑分析方面具有良好的分辨率和高準(zhǔn)確性,可以區(qū)分2-3種模態(tài)的樣本,但是對于外泌體類的樣本,NTA無法分辨外泌體,囊泡和脂蛋白,同時NTA也無法對不同來源的外泌體進(jìn)行區(qū)分。對于DLS,作者認(rèn)為該方法十分簡便,微量樣本即可完成測量,但是該方法測得的粒徑值與真實情況相比偏差較大,并且該方法無法測量樣品顆粒濃度。TEM方法則可以直接實現(xiàn)樣本顆粒的可視化測量,但是該方法成本高昂,費時費力。對于RPS,作者認(rèn)為該方法可以直接測量顆粒真實粒徑(尤其是未知樣本的顆粒特征情況下),并對多模態(tài)的混合樣本有良好的分辨率。

表1. 四種不同粒徑分析方法的特點匯總

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結(jié)論

通過該工作,作者系統(tǒng)的評估了包括濃度,儀器閾值,曝光度,泵流速等因素對NTA性能的影響,他們發(fā)現(xiàn)在濃度為108~109,泵流速為50AU時,對于顆粒樣本可以得到較為精確的表征結(jié)果,同時,他們也提出對于儀器閾值及曝光度這兩個參數(shù),則需要結(jié)合樣本的粒徑具體問題具體分析。同時,他們也發(fā)現(xiàn)NTA對于多分散樣品分析能力不佳,而RPS則可以成功的區(qū)分三峰或四峰樣品,表明RPS對于多分散樣本具有更優(yōu)異的區(qū)分能力。同時作者選用多種表征手段對兩種外泌體進(jìn)行了分析,各個表征手段所得到的粒徑與濃度并不相同,因此作者認(rèn)為在進(jìn)行生物學(xué)顆粒研究時,需要運用正交方法學(xué)對顆粒進(jìn)行多重表征。


參考文獻(xiàn)

Tian Y, Tian D, Peng X, Qiu H. Critical parameters to standardize the size and concentration determination of nanomaterials by nanoparticle tracking analysis. Int J Pharm. Published online April 10, 2024. doi:10.1016/j.ijpharm.2024.124097



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