美國塔夫斯大學(xué) (Tufts University) 的研究人員們報(bào)道了一種熒光免疫標(biāo)記單個 EV 用于 NTA-FL 的優(yōu)化算法，使得基于NTA的單囊泡免疫標(biāo)記和檢測與粒度分布和濃度分析更為精準(zhǔn)。該算法可以有效地提高NTA檢測結(jié)果可信度，為更深入研究 EV 的功能和機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具。

在前期研究中，研究人員們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的利用NTA進(jìn)行EV亞型分析的熒光/散射光比對方法會出現(xiàn)數(shù)據(jù)偏離的情況。通常情況，熒光 (FM) 曲線所圍繞的面積與散射光 (LSM) 曲線所圍繞成的面積的比值可以表示EV的純度。但是這些研究人員們在分析過程中發(fā)現(xiàn)，在測試1，2，4中（表1，圖1），F(xiàn)M（藍(lán)線)與LSM（紅線）的比值大于100%，表明EV純度大于100%，這顯然是不合理的，這種測試結(jié)果表明：

1. 熒光檢測過程中，可能出現(xiàn)了大量的假信號。

2. NTA 系統(tǒng)的技術(shù)限制導(dǎo)致 LSM 無法檢測到非常小的 EV 或折射率低的其他顆粒。散射光模式下EV檢測不全，有部分EV數(shù)據(jù)沒有檢測到，使得LSM面積偏小，從而導(dǎo)致比值大于100%。

3. 研究人員還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)M模式在50 nm以下的區(qū)域還有明顯的信號峰出現(xiàn)，而對比LSM模式，其在50 nm以下信號基本衰減為0，這可能也是造成比值大于100%的原因之一。具體而言，這可能是游離的熒光分子沒有充分去除，以及體系中游離的蛋白質(zhì)被熒光分子標(biāo)記，造成小尺寸分區(qū)中的熒光信號增強(qiáng)。

為了解決這種情況，研究人員們提出了兩種評估方法：

第一種方法是傳統(tǒng)的計(jì)算方法，即計(jì)算樣本中大于 50  nm的顆粒數(shù)量，并比較 FM 和 LSM 中的顆粒數(shù)量，得出 FM 與 LSM 之間的比例。（圖2b，c）

第二種方法是優(yōu)化后的計(jì)算方法，計(jì)算兩種方法得到的粒度分布曲線之間的重疊區(qū)域，并將該區(qū)域與 LSM 中大于 50 納米的顆?？倲?shù)量進(jìn)行比較，得出重疊區(qū)域比例。（圖2d）

在研究過程中，研究人員著重強(qiáng)調(diào)了他們對顆粒粒徑選取的取舍。為了更精確地分析 EV，研究人員將分析范圍縮小到 50-200 納米。之所以選擇這個范圍，是因?yàn)?/span>大多數(shù) EV 的尺寸都在這個范圍內(nèi)。此外，LSM對小于 50 納米的顆粒檢測能力有限，而大于 200 納米的顆粒則可能并非 EV。因此，將分析范圍縮小到 50-200 納米可以有效地排除其他類型的顆粒，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖2 基于NTA的免疫標(biāo)記算法示意圖

表2 算法優(yōu)化后不同樣本的熒光面積 (FM) 與散射光面積 (LSM) 比值（SA）

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