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細胞株構建在新藥研發(fā)中的具體步驟

來源:Bio-Techne   2024年10月22日 10:12  

  細胞株構建在新藥研發(fā)的過程中扮演著至關重要的角色,尤其是對于生物大分子藥物如抗體、重組蛋白、疫苗的開發(fā)而言。一個穩(wěn)定、高產(chǎn)的細胞株不僅是生產(chǎn)這些生物制品的基礎,也是藥物篩選、功效驗證及安全性評估的重要平臺。以下是細胞株構建在新藥研發(fā)中的一般步驟:

  1、目的基因選擇與構建

  根據(jù)藥物設計的目標,選擇需要表達的基因,這可能是編碼抗體輕重鏈的基因片段,或者是某種治療性蛋白質(zhì)的DNA序列。使用分子生物學技術,例如PCR擴增、限制性酶切和連接反應,將目的基因與適當?shù)妮d體(如質(zhì)粒、噬菌體或病毒載體)組裝在一起,形成表達載體。

  2、載體導入與細胞轉染

  選擇合適的宿主細胞,如CHO(中國倉鼠卵巢細胞)、HEK293(人胚胎腎細胞)或昆蟲細胞,這些細胞具有較高的蛋白質(zhì)表達能力和較簡單的培養(yǎng)條件。運用脂質(zhì)體介導、電穿孔或病毒載體等方式,將構建好的表達載體高效導入宿主細胞中,這個過程稱為轉染。

  3、遺傳修飾與細胞篩選

  對于一些需要定點插入或刪除基因的操作,可能會使用CRISPR/Cas9、TALEN或ZFN等基因編輯工具,以獲得特定的細胞表型。轉染后的細胞需要經(jīng)過篩選,通常是通過抗生素抗性標記來淘汰未成功攝取載體的細胞,保留那些已整合有外源基因的細胞。

細胞株構建圖片

 

  4、單克隆細胞株的生成

  為了確保所有細胞都具有相同的遺傳背景和一致的表達特性,需要從初步篩選出的細胞群體中進一步挑選單一的細胞克隆,這一過程稱為單細胞克隆化。可以通過有限稀釋法、克隆缸或流式細胞術(FACS)輔助的克隆化技術來實現(xiàn),最終目的是獲取由單一母細胞衍生的克隆,這樣的細胞株被稱為單克隆細胞株。

  5、克隆篩選與鑒定

  對生成的單克隆細胞株進行一系列的功能測試,包括但不限于基因拷貝數(shù)分析、蛋白質(zhì)表達水平測定、分泌產(chǎn)物的活性檢測等。篩選出表達效率高、產(chǎn)品質(zhì)量好且穩(wěn)定性強的克隆,這些克隆將被作為種子細胞株,用于后續(xù)的擴大培養(yǎng)和商業(yè)化生產(chǎn)準備。

  6、細胞庫建立與管理

  為了長期保存有價值的細胞株并確保其一致性,需要將其冷凍保存在超低溫冰箱或液氮罐中,建立工作細胞庫和主細胞庫。主細胞庫(MasterCellBank,MCB)應來源于原始克隆,未經(jīng)任何額外處理或傳代,而工作細胞庫(WorkingCellBank,WCB)則由MCB復蘇并擴增而來,用于日常實驗和生產(chǎn)。

  7、規(guī)模化生產(chǎn)與質(zhì)量控制

  選定的細胞株會被用于大規(guī)模的發(fā)酵或懸浮培養(yǎng),以達到商業(yè)生產(chǎn)的規(guī)模,這一階段涉及到復雜的生物工藝參數(shù)調(diào)控。生產(chǎn)出來的藥物產(chǎn)品需接受嚴格的純化和質(zhì)量檢驗,包括活性測試、純度分析、殘留物檢測等一系列質(zhì)量控制程序,以確保產(chǎn)品的安全性和有效性。

  細胞株構建貫穿于新藥研發(fā)的早期階段直至后期的規(guī)?;a(chǎn),每一步都需要精心設計和嚴謹執(zhí)行,才能保證最終藥物的質(zhì)量和市場競爭力。這一過程不僅僅是科學技術的體現(xiàn),也是跨學科知識融合與創(chuàng)新思維的結晶。

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