SIRT5-related desuccinylation modification of AIFM1 protects against compression-induced intervertebral disc degeneration by regulating mitochondrial homeostasis

Subject terms: Diseases, Apoptosis, Post-translational modifications, Pathogenesis

椎間盤(pán)退變（IDD）已被廣泛認(rèn)為是腰痛的主要病理原因。椎間盤(pán)（IVD）由中央凝膠狀髓核（NP）、周?chē)w維環(huán)（AF）和軟骨終板（CEP）組成，起到脊柱減震器的作用，以承受機(jī)械沖擊。研究表明，由持續(xù)或過(guò)度機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解和 NP 組織內(nèi)細(xì)胞凋亡在 IDD 的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。

線(xiàn)粒體作為一種高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，不斷進(jìn)行融合和分裂形成動(dòng)態(tài)平衡使細(xì)胞適應(yīng)和響應(yīng)不斷變化的微環(huán)境。NP 組織中的細(xì)胞被認(rèn)為含有一些功能性線(xiàn)粒體，其功能障礙已被證實(shí)是導(dǎo)致 IDD 的主要原因。因此，需要進(jìn)一步研究 IDD 發(fā)展過(guò)程中過(guò)度機(jī)械負(fù)荷與 NP 細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體損傷之間的潛在聯(lián)系。

琥珀?；亲罱l(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，涉及可逆的蛋白質(zhì)修飾過(guò)程，通常發(fā)生在賴(lài)氨酸殘基上，琥珀酰輔酶A（succinyl-CoA）是賴(lài)氨酸琥珀?；妮o因子。由于琥珀酰輔酶A 是在線(xiàn)粒體中產(chǎn)生的，因此琥珀?；钦{(diào)節(jié)線(xiàn)粒體內(nèi)關(guān)鍵代謝過(guò)程的基本生物學(xué)過(guò)程。越來(lái)越多的證據(jù)表明，靶向線(xiàn)粒體蛋白Sirtuin5（SIRT5）的方法wanquannenggou影響蛋白質(zhì)的琥珀酰化，并可以通過(guò)維持線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)來(lái)有效抑制與年齡相關(guān)的退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展。

鑒于此，空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科研究所、菏澤市立醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)科及西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院的科研團(tuán)隊(duì)在一項(xiàng)研究中綜合分析了過(guò)度機(jī)械負(fù)荷對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，證明了SIRT5在壓縮誘導(dǎo)的IDD中發(fā)揮保護(hù)作用，并進(jìn)一步揭示了SIRT5表達(dá)的抑制導(dǎo)致AIFM1的琥珀?；黾樱M(jìn)而消除了AIFM1與CHCHD4之間的相互作用，導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙，最終導(dǎo)致過(guò)度機(jī)械負(fù)荷下IDD的發(fā)展。其研究成果在線(xiàn)發(fā)表于國(guó)際期刊 Experimental & Molecular Medicine 題為“SIRT5-related desuccinylation modification of AIFM1 protects against compression-induced intervertebral disc degeneration by regulating mitochondrial homeostasis”。

首先，為探究機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)NP變性的具體機(jī)制，建立了大鼠尾部加壓模型。GO分析表明，線(xiàn)粒體在機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)的NP組織變性中起著重要作用，壓縮可能影響線(xiàn)粒體中蛋白質(zhì)的定位。此外，加壓組中一些編碼線(xiàn)粒體蛋白的基因，如 Mapk2k、Sirt5、Oxc1的表達(dá)水平顯著降低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，將大鼠NP細(xì)胞在靜態(tài)壓縮 1.0 MPa 的壓縮培養(yǎng)室中培養(yǎng) 0 或 24 小時(shí)，定量分析表明，與未加載的細(xì)胞相比，壓縮的 NP 細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體腫脹和碎片化明顯。此外，用1.0 MPa壓縮處理的NP細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，差異表達(dá)基因集中在線(xiàn)粒體自噬上，進(jìn)一步證實(shí)了機(jī)械應(yīng)力下的線(xiàn)粒體損傷以及線(xiàn)粒體參與壓縮誘導(dǎo)的 IDD。

Sirt5是線(xiàn)粒體中重要的去琥珀?；揎椕?，也是壓縮下變化zuixianzhu的基因。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)表明，1.0 MPa壓縮也以時(shí)間依賴(lài)性方式顯著抑制NP細(xì)胞中SIRT5的表達(dá)。通過(guò)收集不同Pfirrmann等級(jí)MRI圖像的患者樣本進(jìn)一步確認(rèn)IDD與SIRT5表達(dá)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SIRT5表達(dá)與IDD嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，過(guò)度機(jī)械負(fù)荷會(huì)損害 NP 組織內(nèi)的線(xiàn)粒體，并導(dǎo)致線(xiàn)粒體蛋白 SIRT5 的表達(dá)降低，說(shuō)明 SIRT5 可能在壓縮誘導(dǎo)的 IDD 中發(fā)揮重要作用。

然后，研究人員假設(shè) SIRT5 在壓縮誘導(dǎo)的椎間盤(pán)退變中起保護(hù)作用，并在 NP 細(xì)胞中敲低或過(guò)表達(dá)Sirt5（圖1 a）。不出所料，與未處理組相比，si-Sirt5組的蛋白質(zhì)琥珀?；矫黠@較高，lenti-Sirt5組的蛋白質(zhì)琥珀酰化水平顯著較低（圖1 a），這進(jìn)一步證實(shí)了SIRT5在NP細(xì)胞中有效的去琥珀酰酶活性。

此外，Annexin-V/PI（圖1 b）和TUNEL染色（圖1 c、d）實(shí)驗(yàn)表明，Sirt5過(guò)表達(dá)顯著減弱了壓縮誘導(dǎo)的NP細(xì)胞凋亡，而敲低Sirt5則加劇了過(guò)度機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。免疫熒光染色（圖1 c）和蛋白質(zhì)印跡（圖1 e、f）結(jié)果表明，與僅接受機(jī)械應(yīng)力處理的NP細(xì)胞相比，Sirt5過(guò)表達(dá)部分抑制了機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的分解代謝狀態(tài)，包括聚集蛋白聚糖表達(dá)的增加和MMP13表達(dá)的降低。相比之下，敲低 Sirt5 加劇了壓縮誘導(dǎo)的分解代謝狀態(tài)。這些結(jié)果證明，SIRT5的表達(dá)在保護(hù)NP細(xì)胞免受機(jī)械應(yīng)力方面起著至關(guān)重要的作用，而SIRT5對(duì)于維持體外NP穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。

圖1    SIRT5保護(hù)NP細(xì)胞免受壓縮誘導(dǎo)的凋亡和功能障礙。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SIRT5對(duì)機(jī)械應(yīng)力下NP組織的保護(hù)作用，對(duì)WT小鼠或Sirt5 KO小鼠（WT sham組；KO sham組；WT LSI組；KO LSI組）進(jìn)行了腰椎不穩(wěn)（LSI）或假手術(shù)，評(píng)估椎間盤(pán)退變的程度（圖2 a、c）。與WT+LSI組相比，KO+LSI組的IVDs，尤其是IVDs的L2-3和L3-4段的T2信號(hào)強(qiáng)度明顯降低，而WT假手術(shù)組和KO假手術(shù)組的T2信號(hào)強(qiáng)度沒(méi)有差異（圖2 b），表明在持續(xù)的機(jī)械應(yīng)力下，Sirt5缺失小鼠的NP組織中的ECM降解更快。

此外，與WT小鼠相比，Sirt5-null小鼠的椎間盤(pán)高度指數(shù)（DHI）下降得更嚴(yán)重（圖2 d），表明在持續(xù)的機(jī)械負(fù)荷下，Sirt5缺失小鼠的椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)受到更嚴(yán)重的損傷。與此一致，組織學(xué)和免疫熒光染色分析也顯示，Sirt5-null小鼠的NP組織退行性變化更嚴(yán)重（圖2 e）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Sirt5 KO小鼠以加速模式進(jìn)展為L(zhǎng)SI誘導(dǎo)的IDD，這進(jìn)一步證實(shí)了SIRT5在NP組織中對(duì)抗過(guò)度機(jī)械負(fù)荷的重要作用?？紤]到受壓下NP細(xì)胞中線(xiàn)粒體損傷和SIRT5的表達(dá)減少，研究推測(cè)SIRT5通過(guò)維持線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)起到保護(hù)作用。

因此，監(jiān)測(cè)了用 si-Sirt5 或陰性對(duì)照（si-NC）處理的 NP 細(xì)胞的線(xiàn)粒體形態(tài)、組成和能量代謝，發(fā)現(xiàn)在Si-NC處理下，NP細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)線(xiàn)粒體呈現(xiàn)完整結(jié)構(gòu)，而用si-Sirt5處理的細(xì)胞則表現(xiàn)出線(xiàn)粒體腫脹和碎片化。此外，si-Sirt5處理的NP細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的代謝減弱，電子轉(zhuǎn)移鏈（ETC）復(fù)合物蛋白顯著減少。這些結(jié)果表明，SIRT5在調(diào)節(jié)NP細(xì)胞的線(xiàn)粒體形態(tài)、組成和能量代謝方面起著重要作用，其敲低導(dǎo)致線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)受損。

圖2    Sirt5 KO小鼠在LSI手術(shù)后表現(xiàn)出更嚴(yán)重的 IVDs退行性表型。

進(jìn)一步地，為探究SIRT5參與線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)控的具體分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)通過(guò)Co-IP獲得NP細(xì)胞的SIRT5結(jié)合蛋白，并通過(guò)質(zhì)譜（MS）和數(shù)據(jù)庫(kù)生物信息學(xué)分析鑒定了其結(jié)合靶點(diǎn)——凋亡誘導(dǎo)因子線(xiàn)粒體相關(guān)1（AIFM1）。AIFM1 通過(guò)固定線(xiàn)粒體內(nèi)膜中的 CHCHD4，確保 CHCHD4 在氧化和穩(wěn)定線(xiàn)粒體輸入小分子中的作用。蛋白質(zhì)印跡和免疫染色結(jié)果顯示，SIRT5的Co-IP產(chǎn)物中檢出AIFM1，AIFM1的反向Co-IP產(chǎn)物中也檢出SIRT5，且SIRT5 和 AIFM1 在 NP 細(xì)胞中具有很強(qiáng)的共定位性，確認(rèn)了兩個(gè)分子之間的直接相互作用。

研究人員假設(shè) SIRT5 通過(guò)去琥珀?；{(diào)節(jié) AIFM1 的翻譯后修飾。琥珀?；囼?yàn)結(jié)果表明，通過(guò)添加琥珀酰輔酶A，NP細(xì)胞中琥珀酰化的AIFM1以劑量依賴(lài)性方式增加。此外，敲低Sirt5顯著增加了NP細(xì)胞中AIFM1的琥珀?；?，但敲低Sirt5對(duì)NP細(xì)胞中AIFM1和CHCHD4的表達(dá)無(wú)顯著影響，而與AIFM1結(jié)合的CHCHD4總量顯著減少。

體外琥珀?；瘻y(cè)定發(fā)現(xiàn)，加入琥珀酰輔酶A后AIFM1的琥珀?；黾樱cAIFM1結(jié)合的CHCHD4減少。此外，在用si-Sirt5處理的NP細(xì)胞的線(xiàn)粒體中，CHCHD4（而非AIFM1）的豐度顯著降低，進(jìn)一步證實(shí) Sirt5 的敲低會(huì)損害 AIFM1-CHCHD4 復(fù)合物的活性。這些結(jié)果表明，由于其去琥珀?；富钚?，SIRT5表達(dá)降低增強(qiáng)了AIFM1的琥珀酰化，這反過(guò)來(lái)消除了AIFM1和CHCHD4之間的相互作用，從而損害了AIFM1-CHCHD4復(fù)合物的運(yùn)輸功能。

為了驗(yàn)證 SIRT5 和 AIFM1-CHCHD4 復(fù)合物在機(jī)械應(yīng)力下線(xiàn)粒體功能障礙和 NP 細(xì)胞變性中的作用，分別敲低 NP 細(xì)胞中的 Aifm1 和 Chchd4。蛋白質(zhì)印跡測(cè)定（圖3 a）表明，機(jī)械應(yīng)力下ETC復(fù)合蛋白的表達(dá)顯著降低。Sirt5的過(guò)表達(dá)部分恢復(fù)了ETC復(fù)合蛋白的降低。然而，敲低Aifm1或Chchd4消除了SIRT5在機(jī)械應(yīng)力下的挽救作用（圖3 a-f）。此外，NP細(xì)胞中線(xiàn)粒體形態(tài)在機(jī)械應(yīng)力下受到破壞（圖3 h），Sirt5的過(guò)表達(dá)部分抑制了線(xiàn)粒體的形態(tài)損傷，而敲低Aifm1或Chchd4則消除了這種作用。同樣，敲除Aifm1或Chchd4也消除了SIRT5在機(jī)械應(yīng)力下對(duì)ATP合成的拯救作用（圖3 g）。

檢測(cè) SIRT5 和 AIFM1-CHCHD4 復(fù)合物在機(jī)械應(yīng)力下維持 NP 細(xì)胞活力的作用（圖3 i），同樣發(fā)現(xiàn)Sirt5過(guò)表達(dá)抑制了壓縮誘導(dǎo)的NP細(xì)胞凋亡，而敲低Aifm1或Chchd4則逆轉(zhuǎn)了這種保護(hù)作用（圖3 i、j）。此外，Sirt5過(guò)表達(dá)顯著抑制了ECM在壓縮下的降解，而敲低AIFM1或CHCHD4也消除了SIRT5的這種保護(hù)作用（圖3 k-p）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，過(guò)度的機(jī)械負(fù)荷通過(guò) SIRT5-AIFM1-CHCHD4 通路導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙和 NP 細(xì)胞變性。

圖3   敲低Aifm1或Chchd4顯著逆轉(zhuǎn)了Sirt5過(guò)表達(dá)對(duì)壓縮下NP細(xì)胞的保護(hù)作用。

最后，為了確定上述發(fā)現(xiàn)是否具有潛在的轉(zhuǎn)化意義，進(jìn)行大鼠尾部壓縮或假手術(shù)，然后在椎間盤(pán)內(nèi)過(guò)表達(dá)Sirt5 或腹膜內(nèi)注射亞甲藍(lán)（MB，一種可替代的線(xiàn)粒體電子轉(zhuǎn)移載體，可恢復(fù)由 AIF 缺乏引起的線(xiàn)粒體功能障礙）。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)Sirt5或MB處理部分恢復(fù)了靜態(tài)壓縮誘導(dǎo)的Pfirrmann等級(jí)升高，以及逆轉(zhuǎn)壓縮導(dǎo)致的椎間盤(pán)高度降低，并成功改善了機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的組織學(xué)損傷。此外，機(jī)械應(yīng)力作用下NP組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞和MMP13表達(dá)增加，SIRT5、Aggrecan和CHCHD4表達(dá)減少，但Lenti-Sirt5和MB處理均能部分逆轉(zhuǎn)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的表型變化。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證明了SIRT5-AIFM1-CHCHD4通路在調(diào)節(jié)IVD穩(wěn)態(tài)中的作用，并證實(shí)了Sirt5過(guò)表達(dá)或MB給藥對(duì)體內(nèi)IDD過(guò)程的治療作用。

圖4    NP細(xì)胞內(nèi)壓縮誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體功能障礙機(jī)制的示意圖。

過(guò)高的機(jī)械負(fù)荷通過(guò)降低去琥珀酰酶 SIRT5 的表達(dá)來(lái)增加 NP 細(xì)胞內(nèi) AIFM1 的琥珀?；?，進(jìn)而消除 AIFM1 和 CHCHD4 之間的相互作用，導(dǎo)致 CHCHD4 依賴(lài)性線(xiàn)粒體膜間空間成分輸入的破壞，從而減少線(xiàn)粒體 ETC 復(fù)合物亞基。減少的ETC復(fù)合物亞基最終導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙，并在過(guò)度機(jī)械負(fù)荷下促進(jìn)IDD的發(fā)展。

綜上所述，該研究揭示了機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的椎間盤(pán)退化的新分子機(jī)制。研究結(jié)果shouci證明，過(guò)度的機(jī)械負(fù)荷通過(guò)降低去琥珀?；窼IRT5的表達(dá)來(lái)增加NP細(xì)胞中的琥珀?；剑瑩p害線(xiàn)粒體功能并導(dǎo)致隨后的IDD發(fā)生，并通過(guò)上調(diào) Sirt5 表達(dá)或 MB 給藥，評(píng)估了兩種不同治療方法在壓力誘導(dǎo)的大鼠椎間盤(pán)退變模型中靶向破壞線(xiàn)粒體蛋白輸入治療的有效性。這項(xiàng)研究為IDD的發(fā)生和發(fā)展提供了新的見(jiàn)解，并為IDD提供了有希望的治療方法。

參考文獻(xiàn)：Mao J, Wang D, Wang D, Wu Q, Shang Q, Gao C, Wang H, Wang H, Du M, Peng P, Jia H, Xu X, Wang J, Yang L, Luo Z. SIRT5-related desuccinylation modification of AIFM1 protects against compression-induced intervertebral disc degeneration by regulating mitochondrial homeostasis. Exp Mol Med. 2023 Jan;55(1):253-268. doi: 10.1038/s12276-023-00928-y. Epub 2023 Jan 18. PMID: 36653443; PMCID: PMC9898264.

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