?

 近年來，液體活檢技術(shù)發(fā)展備受關(guān)注，其相對于常規(guī)組織活檢技術(shù)具有侵入性小、快速便捷、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，因此在癌癥的早篩、早診等方面產(chǎn)生了諸多突破性進(jìn)展。它通過分析血液或尿液等中的生物標(biāo)記物，如比較熱門的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）來檢測癌癥的存在。然而，由于ctDNA僅能檢測DNA，且會受到其它因素污染，因此對循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）如RNA和蛋白質(zhì)的分析變得越來越重要（如圖1），而隨著代謝組學(xué)的發(fā)展，越來越多的代謝物標(biāo)志物被認(rèn)為是潛在的反映癌癥發(fā)生的敏感標(biāo)記物。從血液中分離出活的CTCs，將其進(jìn)行濃縮，并了解培養(yǎng)癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中所含微量代謝物的變化，可為液體活檢研究做出重大貢獻(xiàn)。

圖1 液體活檢研究目標(biāo)概述

利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）的方法即可以對培養(yǎng)基中的初級代謝物進(jìn)行分析，然而GC-MS對于代謝物的快速篩查及代謝通路研究方面仍存在一定挑戰(zhàn)，為了克服這些挑戰(zhàn)，島津針對代謝物分析開發(fā)了專用的GC-MS數(shù)據(jù)庫（Smart Metabolites Database），其涵蓋600多種化合物的質(zhì)譜圖、保留指數(shù)、MRM離子對等信息，可在無標(biāo)準(zhǔn)品的情況下快速排除干擾組分輕松實(shí)現(xiàn)樣品中代謝物的快速篩查。

本應(yīng)用即利用島津GCMS-TQ8040 NX和Smart Metabolites Database Ver.2在23分鐘內(nèi)就完成了兩種CTCs樣品(H358和H1975肺癌細(xì)胞)中500多種代謝組分的同時(shí)測定。這兩種CTCs通過智能活檢細(xì)胞分離器（Smart Biopay Cell Isolator）分離獲得，并分別在0、1、10、50和100個(gè)細(xì)胞的獨(dú)立培養(yǎng)基中培養(yǎng)。智能活檢細(xì)胞分離器采用基于重力過濾的HDM技術(shù)，通過特殊涂層更大限度地提高回收率，每個(gè)樣品均以高通量的方式在25分鐘內(nèi)分離活CTCs。然后使用eMSTAT Solution Ver.2和多組學(xué)分析方法包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過可視化的方法呈現(xiàn)ANOVA（方差分析）和代謝通路圖的結(jié)果，進(jìn)而了解CTC數(shù)量與代謝通路上的代謝物之間的相關(guān)性。

利用ANOVA進(jìn)行代謝通路分析

下圖2中通過ANOVA計(jì)算未使用的培養(yǎng)基（含0個(gè)癌癥細(xì)胞的培養(yǎng)基，藍(lán)色）、含有50/100個(gè)H358肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)基（紅色）和含有50/100個(gè)H1975肺癌細(xì)胞（黃色）的培養(yǎng)基的p值，并將p值在5%及以下的代謝物投影到多組學(xué)分析方法包的代謝物通路圖上。

可以看出，在H358培養(yǎng)基中，甘油酯代謝通路上游區(qū)域的底物（二羥丙酮磷酸和甘油磷酸酯)水平特別低，甲基乙二醛是二羥丙酮磷酸的副產(chǎn)物，由于糖酵解的增加，癌細(xì)胞傾向于產(chǎn)生甲基乙二醛作為副產(chǎn)物。

圖2 使用eMSTAT Soutions Ver.2進(jìn)行ANOVA，并將結(jié)果投影到多組學(xué)分析方法包的代謝通路圖上

CTC數(shù)量與代謝通路上的代謝物的相關(guān)性分析

利用多組學(xué)方法包的代謝通路分析功能，進(jìn)行CTC數(shù)量（0、1、10、50、100）與代謝物之間的相關(guān)性分析（如圖3）。結(jié)果顯示，色氨酸通路中的中間代謝物多巴胺與H358呈正相關(guān)（據(jù)了解肺癌患者血漿中的多巴胺水平明顯高于健康受試者，其因果關(guān)系有望在以后的研究中得到闡明）。此外，在甘油三酯合成通路中，甘油磷酸酯與H358細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，眾所周知，將甘油磷酸酯轉(zhuǎn)化為1,3-二磷酸甘油酸的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（NADP+）在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)中甘油磷酸酯的減少也被認(rèn)為是由于甘油醛-3-磷酸脫氫酶（NADP+）的增加。

圖3 搜索與CTC計(jì)數(shù)相關(guān)的代謝物

結(jié)論                     

通過GC-MS和智能代謝物數(shù)據(jù)庫分析培養(yǎng)了癌癥細(xì)胞的培養(yǎng)基中代謝物的情況，并結(jié)合多組學(xué)方法包的代謝通路分析功能，分析CTC數(shù)量與代謝物之間的相關(guān)性，將有助于液體活檢相關(guān)的方法研究。

代謝物數(shù)據(jù)庫特點(diǎn)

• 超過600種代謝化合物信息，提供氨基酸、脂肪酸和糖的專用分析方法，輕松實(shí)現(xiàn)代謝物泛范圍篩查。

• 代謝物MRM信息數(shù)據(jù)庫，無需標(biāo)準(zhǔn)品即可快速創(chuàng)建高靈敏度分析方法

• 新增糖專用分析方法和功能性成分化合物信息擴(kuò)展樣品分析范圍

• 新增過濾功能，允許用戶只選擇和分析給定樣品中可能被檢測到的代謝物，節(jié)省分析時(shí)間和勞動力

• “代謝組學(xué)手冊”全方位說明從樣品準(zhǔn)備到多變量分析的每個(gè)步驟，即使是初學(xué)者亦可以輕松應(yīng)對。

實(shí)驗(yàn)儀器

聲明：本文涉及內(nèi)容非醫(yī)療用途，僅供專業(yè)人士學(xué)習(xí)及相關(guān)研究參考使用

本文內(nèi)容非商業(yè)廣告，僅供專業(yè)人士參考。