包含自革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS）在內(nèi)的熱原是可引起發(fā)熱的物質(zhì)，也是醫(yī)藥制品中的有害污染物。當(dāng)醫(yī)藥制品與血液和器官直接接觸時(shí)，其可能包含的熱原會(huì)激活人體的先天免疫機(jī)制，從而可能導(dǎo)致高燒、炎癥、組織損傷、敗血癥和休克。^[1]因此，為了滿(mǎn)足監(jiān)管要求，醫(yī)藥制品需要進(jìn)行熱原檢測(cè)，這也是藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量規(guī)格的一部分。^[1]

◆熱原的歷史背景

1875年，伯頓-桑德森（Burdon-Sanderson）提出了 "熱原"（pyrogen）一詞，用來(lái)描述在腐肉的無(wú)菌提取物中發(fā)現(xiàn)的一種假設(shè)物質(zhì)，注射后會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)熱。1911年，韋赫塞爾曼（Wechselman）發(fā)現(xiàn)在注射灑爾佛散（Salvarsan，一種治療梅毒的藥物）時(shí)，會(huì)因蒸餾水中的細(xì)菌導(dǎo)致患者發(fā)熱，這促使他開(kāi)始尋找解決方案。然而，灑爾佛散不能口服，只能通過(guò)注射起效。因這種注射藥物變得普遍，熱原控制變得至關(guān)重要 ^[2] 。

◆熱原檢測(cè)

家兔熱原試驗(yàn)（RPT)

Hort和Penfeld于1912年進(jìn)行了家兔熱原試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌在家兔身上出現(xiàn)明顯的熱原反應(yīng)，而革蘭氏陽(yáng)性菌的反應(yīng)則輕微得多^[2]。在家兔熱原試驗(yàn)中，通過(guò)給家兔注射熱原并記錄體溫升高的發(fā)熱反應(yīng)。但家兔對(duì)熱原的反應(yīng)可能與人體的反應(yīng)具有差異，因此檢測(cè)存在一定的局限性。

鱟試驗(yàn)法（LAL）

鱟試驗(yàn)法（LAL，也稱(chēng)鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物檢測(cè)法）又稱(chēng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法（BET），是一種經(jīng)濟(jì)且獲得廣泛認(rèn)可的替代方法。鱟試驗(yàn)法通過(guò)將鱟血液與細(xì)菌內(nèi)毒素混合，最終形成一種凝膠或顯色。目前的鱟試驗(yàn)法試劑盒通過(guò)利用這種裂解物的濁度特性或顯色特性進(jìn)行檢測(cè)。在熱原檢測(cè)方面，鱟試驗(yàn)法的靈敏度已被證明是家兔法的5倍^[3]。

此外，使用氯化鈣溶液對(duì)放射性藥物的鱟試驗(yàn)法進(jìn)行改良，可避免因螯合劑而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。具體為螯合劑的存在會(huì)降低LAL試劑中游離二價(jià)鈣離子的濃度，從而抑制凝固素凝膠的形成，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。目前，美國(guó)醫(yī)院和中央放射藥房采用這種改良的LAL檢測(cè)法，用于放射性藥物和試劑盒的質(zhì)量控制檢測(cè)^[4]。

MAT法（單核細(xì)胞活化試驗(yàn)）

MAT法（單核細(xì)胞活化試驗(yàn)）可用于識(shí)別和定量?jī)?nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩?。熱原可激活人體內(nèi)的單核細(xì)胞，從而釋放介質(zhì)^[5]。MAT法通過(guò)在體外將人單核細(xì)胞暴露于熱原從而激活單核細(xì)胞，引發(fā)促炎細(xì)胞因子的釋放，隨后可使用ELISA技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定量^[6]。MAT法使用人體細(xì)胞，因此更具生理相關(guān)性，可以精確地定量識(shí)別和檢測(cè)內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩?/span>^[7]。

◆未來(lái)展望

從家兔熱原試驗(yàn)到MAT法的轉(zhuǎn)變充滿(mǎn)挑戰(zhàn)，需要付出巨大的努力。歐洲藥品質(zhì)量管理局、歐洲委員會(huì)和歐洲動(dòng)物試驗(yàn)替代方法合作組織共同舉辦了 "熱原性試驗(yàn)的未來(lái)：逐步淘汰家兔熱原試驗(yàn) "的國(guó)際會(huì)議，會(huì)議重點(diǎn)討論了2026年前從歐洲藥典中刪除家兔熱原試驗(yàn)、高效推動(dòng)MAT法應(yīng)用的使命，并指出在淘汰家兔熱原檢測(cè)方面還存在的差距^[8]。

此外，為符合FDA指南，使用MAT法前必須執(zhí)行特定于產(chǎn)品的驗(yàn)證，以確認(rèn)使用MAT法評(píng)估特定檢測(cè)物質(zhì)或材料的適用性。驗(yàn)證過(guò)程應(yīng)包含對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)和精確熱原檢測(cè)等多種測(cè)試，同時(shí)還需要保證設(shè)備與單核細(xì)胞之間的直接接觸^[9]。

參考文獻(xiàn)

1.  Spoladore, J., et al., Standardized pyrogen testing of medical products with the bacterial endotoxin test (BET) as a substitute for 

     rabbit Pyrogen testing (RPT): A scoping review. Toxicol In Vitro, 2021. 74: p. 105160.

2. Hartung, T., The human whole blood pyrogen test – lessons learned in twenty years. ALTEX - Alternatives to animal experimentation, 

    2015. 32(2):p. 79-100.

3.  Karesh, S.M.J.J.o.n.m.t., Sterility and pyrogen testing of radiopharmaceuticals. 1989. 17(3): p. 156-159.

4.  Mitra, A., et al., Limulus amebocyte lysate testing: adapting it for determination of bacterial endotoxin in 99mTc-labeled 

    radiopharmaceuticals at a hospital radiopharmacy. J Nucl Med Technol, 2014. 42(4): p. 278-82.

5.  Solati, S., T. Zhang, and S. Timman, The monocyte activation test detects potentiated cytokine release resulting from the synergistic

     effect of endotoxin and non-endotoxin pyrogens. Innate Immun, 2022. 28(3-4): p. 130-137.

6.  Perdomo-Morales, R., et al., Monocyte activation test (MAT) reliably detects pyrogens in parenteral formulations of human serum

     albumin. Altex, 2011.28(3): p. 227-35.

7.  Carson, D., et al., Development of a Monocyte Activation Test as an Alternative to the Rabbit Pyrogen Test for Mono- and Multi-

    Component Shigella GMMA-Based Vaccines. 2021. 9(7): p. 1375.

8.  Cirefice, G., et al., The future of pyrogenicity testing: Phasing out the rabbit pyrogen test. A meeting report. Biologicals, 2023. 84: p.

    101702.

9. Sandle, T., FDA guidance on pyrogens and endotoxin testing.

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