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如何對pcr結(jié)果進(jìn)行分析?

來源:天津益元利康生物科技有限公司   2024年11月12日 10:18  

一、PCR結(jié)果分析的基本步驟?

1.基線設(shè)置?:實時PCR反應(yīng)的基線是指在PCR的初始循環(huán)期間的信號水平,通常是315個循環(huán)之間,此時熒光信號幾乎沒有變化,可以認(rèn)為是背景或反應(yīng)的噪音。

2. ?閾值設(shè)定??qPCR的閾值代表的是明顯超出基線的擴(kuò)增信號水平,用以區(qū)分明確的擴(kuò)增信號和背景。通常qPCR儀器自帶軟件會自動將閾值設(shè)置為基線熒光值標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

3. ?CT值計算?Ct是指熒光信號超過閾值時對應(yīng)的循環(huán)數(shù),Ct值與目的基因的起始量成反比,可用于計算DNA初始拷貝數(shù)。

4. ?擴(kuò)增曲線分析?:擴(kuò)增曲線有兩種展現(xiàn)形式,一種是線性,一種是對數(shù)形式。通常用CT來推算樣品中樣品的濃度,CT值越高說明模板濃度越低。

5. ?標(biāo)準(zhǔn)曲線?:將已知濃度的樣品(標(biāo)準(zhǔn)品)經(jīng)過梯度稀釋后分別取樣進(jìn)行熒光定量PCR,得到的一系列Ct值與Log模板數(shù)對應(yīng)可以得到一個相關(guān)的曲線,即標(biāo)準(zhǔn)曲線。這個標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用來判斷熒光定量PCR體系的優(yōu)劣。

6. ?熔解曲線分析?PCR產(chǎn)物進(jìn)行逐步升溫監(jiān)測,可以看到在達(dá)到其解鏈溫度時,熒光信號會有一個忽然的下降。理論上如果PCR得到特異性產(chǎn)物則只有一個Tm值,在溶解曲線上表示只有單峰存在。如果是多相峰,可以判斷產(chǎn)物不是單一的,發(fā)生了非特異擴(kuò)增。

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二、不同PCR技術(shù)的結(jié)果分析方法

1. ?第一代PCR技術(shù)?:采用瓊脂糖電泳的方式對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析,通過電泳判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小,用于臨床檢測。

2. ?第二代PCR技術(shù)?:熒光定量PCRqPCR),通過設(shè)置基線、閾值和CT值進(jìn)行定量分析,適用于需要精確測量DNARNA含量的實驗。

3. ?第三代PCR技術(shù)?:以微滴化處理步驟為主要特征,提高了檢測的靈敏度和特異性,適用于更復(fù)雜的實驗需求。


三、具體實驗操作步驟

1. ?樣品處理?:將樣品進(jìn)行稀釋和離心處理,確保DNAwanquan裂解和分離。

2. ?PCR反應(yīng)?:按照試劑盒說明書操作,將反應(yīng)管與凍干成分一起離心,添加緩沖液和引物/探針/核苷酸混合物,進(jìn)行PCR反應(yīng)。

3. ?結(jié)果分析?:通過基線、閾值、CT值和擴(kuò)增曲線等參數(shù)分析PCR結(jié)果,比較實驗組和對照組的差異,確定基因表達(dá)的變化。


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