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植物的自身熒光模糊的去除
農(nóng)學(xué)
何謂自身熒光
基于自身熒光的植物觀察的課題與對策
獲取沒有熒光模糊的清晰圖像的方法
何謂自身熒光
自身熒光的原理
自身熒光（autofluorescence）是指，由細(xì)胞結(jié)構(gòu)或特性等產(chǎn)生的自然放光（光致發(fā)光：PL）。向物質(zhì)照射激發(fā)光時，由于吸收光（光子）的能量，電子處于激發(fā)狀態(tài)。從此狀態(tài)返回基底狀態(tài)時發(fā)出的光就是光致發(fā)光原理。細(xì)胞內(nèi)的線粒體或溶酶體等細(xì)胞器（細(xì)胞小器官）、膠原蛋白或彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)、NADH或核黃素等黃酮類的環(huán)狀化合物具有可發(fā)出熒光的構(gòu)造，由此表現(xiàn)出自身熒光。在植物細(xì)胞中，表現(xiàn)出自身熒光的典型物質(zhì)有葉綠素（與光合作用相關(guān)的葉綠體）或細(xì)胞壁內(nèi)木質(zhì)素等。
自身熒光的波長
一般情況下，自身熒光被350至500 nm波長的光激發(fā)，并發(fā)出350至550 nm的短波長光。
例如，發(fā)出自身熒光的典型環(huán)狀化合物NADH被340 nm左右的波長激發(fā)，并發(fā)出460 nm波長為主的藍(lán)色自身熒光。另一方面，在植物的光合作用中利用吸收的光發(fā)揮激發(fā)能量作用的葉綠素，發(fā)出680 nm波長為主的自身熒光。
掌握不同物質(zhì)的激發(fā)光波長及其響應(yīng)性、自身熒光波長，對清晰地觀察目標(biāo)物質(zhì)或組織尤為重要。
基于自身熒光的植物觀察的課題與對策
植物熒光觀察的課題
在觀察植物等多細(xì)胞生物時，一般利用熒光蛋白質(zhì)選擇性地標(biāo)示目標(biāo)細(xì)胞或結(jié)構(gòu)，并通過放大細(xì)胞或結(jié)構(gòu)來進(jìn)行詳細(xì)觀察。但是，在植物熒光觀察中，若作為觀察目標(biāo)的細(xì)胞或蛋白質(zhì)的信號微弱時，自身熒光會干擾識別，尤其在觀察植物細(xì)胞時，葉綠素等發(fā)出自身熒光的物質(zhì)是造成熒光模糊的典型因素。
植物的自身熒光導(dǎo)致的熒光模糊使目標(biāo)物質(zhì)的觀察更加困難，因此如何實(shí)施熒光模糊對策，從而獲取易于觀察、分析的清晰圖像就成為了課題。
自身熒光導(dǎo)致的熒光模糊對策
例如在植物細(xì)胞觀察中，防止葉綠素的自身熒光造成妨礙的對策一般采用濾光片。
如上所述，葉綠素的自身熒光以680 nm為峰值的狹小范圍波長發(fā)出。使用符合該波長區(qū)域的熒光濾光片套件，排除680 nm左右的波長后進(jìn)行觀察，從而在抑制熒光模糊等自身熒光影響的情況下進(jìn)行熒光觀察。
另外，在無法確定引起熒光模糊的自身熒光波長，或不具有固有波長特性時，采取首先通過標(biāo)準(zhǔn)熒光濾光片組件嘗試各種波長，以找出可排除自身熒光的波長，然后使用該濾光片讓目標(biāo)物質(zhì)更易于觀察的方法。
植物觀察的課題與要求
利用濾光片去除自身熒光產(chǎn)生的熒光模糊的方法，在確定可排除自身熒光的波長及與其對應(yīng)的濾光片上需要花費(fèi)時間與精力。此外，在觀察植物細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)時，需解剖器官，或?qū)⒔M織切成薄片制作切片標(biāo)本。制作這些標(biāo)本需要具備高超的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)。同時在制作標(biāo)本時，有可能對植物施加機(jī)械力而發(fā)生意外反應(yīng)。
而且，通過組織切片等二維圖像難以分析、評價實(shí)際的三維結(jié)構(gòu)。因此，如何利用熒光模糊少而清晰的圖像選擇性觀察目標(biāo)細(xì)胞或組織，進(jìn)而準(zhǔn)確高效地觀察三維結(jié)構(gòu)，成為植物研究上的重大課題，也是重要的需求。
獲取沒有熒光模糊的清晰圖像的方法
全新熒光顯微成像系統(tǒng)能夠簡單快速地獲取沒有熒光模糊的清晰圖像，進(jìn)而滿足實(shí)現(xiàn)三維觀察等的各種課題或要求。下面使用實(shí)際的植物（土豆）觀察圖像，介紹植物觀察課題的解決案例及其方法。
消除自身熒光模糊的清晰全幅對焦圖像
基恩士的一體化熒光顯微成像系統(tǒng)BZ-X800在不使用激光的情況下憑借光學(xué)手法消除自身熒光導(dǎo)致熒光模糊的“光學(xué)切片”功能，輕松獲取清晰圖像。
光學(xué)切片是指，通過使用“光學(xué)切片算法”*消除熒光模糊，從而只保留調(diào)焦點(diǎn)位置上鮮明的熒光，由此簡單快速地獲取清晰圖像的功能。并且，通過使用光學(xué)切片功能的同時在Z軸方向拍攝多張圖像，在標(biāo)本的縱深方向上的各種高度不受熒光模糊的影響，僅獲取準(zhǔn)確的熒光信號。只從拍攝的多個圖像中檢測并合成焦點(diǎn)對準(zhǔn)的部分，可構(gòu)建焦點(diǎn)對準(zhǔn)整體的全幅對焦圖像。由此，可以省去從濾光片套件中尋找要消除波長的對應(yīng)濾光片的時間與精力，得以立即觀察清晰圖像。
如果引進(jìn)一體化熒光顯微成像系統(tǒng)BZ-X800
通過消除熒光模糊的光學(xué)切片功能，可輕松獲取清晰圖像。
在Z軸方向以最小100nm的節(jié)距連續(xù)拍攝多張圖像的Z棧功能，及從這些圖像中只抽取對焦部分并進(jìn)行合成的全幅對焦功能，實(shí)現(xiàn)對標(biāo)本縱深整體對焦的全幅對焦圖像觀察。
基于通過光學(xué)切片功能獲取的Z棧圖像，可輕松構(gòu)建準(zhǔn)確的高精度3D圖像。
只通過鼠標(biāo)操作，即可自由進(jìn)行3D圖像的旋轉(zhuǎn)、變焦、截面觀察，在各種角度都可正確掌握熒光信號的定位。
熒光顯微成像系統(tǒng) 產(chǎn)品目錄
有關(guān)新型一體化熒光顯微成像系統(tǒng)BZ-X800的詳情，請參閱產(chǎn)品目錄。
如需進(jìn)一步了解詳情
基恩士還準(zhǔn)備了活用事例集，請務(wù)必一看。
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