抗體藥物是以細胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)為主體的抗體工程技術(shù)制備的藥物，具有特異性高、性質(zhì)均一、可針對特定靶點定向制備等優(yōu)點，目前被廣泛用在抗腫瘤領域和自身免疫類領域的疾病治療中。基于抗體的生物療法是制藥市場增長最快的細分市場之一，因其具有高選擇性和理想的藥理學特性，且同小分子藥相比，研發(fā)周期短、開發(fā)成功率高。根據(jù)Frost & Sullivan的統(tǒng)計預測，到2030年全球抗體藥物市場規(guī)模預計增至4,431億美元，中國的抗體藥物市場規(guī)模預計達5108億，CAGR近20%。

抗體類藥物可以分為：單克隆抗體、雙特異性抗體、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）、Fc融合蛋白、抗體片段和多克隆抗體等。目前全球及中國抗體藥物市場均以單克隆抗體為主，未來將向多特異性抗體發(fā)展，ADC藥物的市場規(guī)模國內(nèi)外也都在迅速增長。

抗體藥物從早期研發(fā)、到成功上市需要經(jīng)歷多個階段，每個階段都存在極其復雜的不確定性，需要對其中多個關鍵點進行嚴格的質(zhì)量控制，從而確保最終產(chǎn)品的安全性和有效性。

圖1.抗體藥研發(fā)及生產(chǎn)流程中翌圣質(zhì)控產(chǎn)品推薦

相較于傳統(tǒng)化學藥物，以基因治療、細胞治療或組織工程為基礎的新型生物治療業(yè)已成為前沿性治療藥物。這些藥物大多以細胞為載體制備或構(gòu)建，因此，在此過程中，對于細胞種子庫、病毒培養(yǎng)和收獲、臨床治療用途的細胞等生物制品中生產(chǎn)制備過程易受到支原體污染。

支原體是一種比較常見但通常難以去除的污染類型，對于涉及細胞培養(yǎng)的生物制品工藝過程，法規(guī)要求“必須確保無支原體污染”。目前國內(nèi)外藥典推薦的支原體檢測方法主要是基于培養(yǎng)法、NAT(核酸擴增法)法、細胞培養(yǎng)指示法。

翌圣生物MycAway®支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）(2G)是基于NAT法的一種快速定性檢測生產(chǎn)原料、細胞庫、病毒種子、病毒或細胞收獲液、治療用細胞中潛在支原體污染的產(chǎn)品。該試劑盒基于定量PCR技術(shù)，使用Taqman熒光探針定性檢測待測樣本中支原體DNA，可覆蓋183種支原體DNA序列；并且嚴格按照EP 2.6.7和JP G3支原體檢測相關指南和要求進行驗證，具備靈敏度高、特異性好、安全性好等特點。該試劑盒還能夠與MolPure®磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒搭配使用，通過手動提取或者使用自動化核酸提取儀自動提取樣本核酸，再由qPCR收集探針的熒光信號，從而對檢測結(jié)果進行判定。

圖2.翌圣生物NAT法支原體qPCR檢測實驗流程

去除宿主細胞雜質(zhì)是抗體藥物在內(nèi)的生物制藥產(chǎn)品生產(chǎn)中的關鍵步驟，其中宿主細胞殘留DNA由于可能存在的免疫原性、感染性以及致瘤性等安全問題成為關鍵質(zhì)控指標。在此情況下，建立合適的檢測方法監(jiān)測生產(chǎn)工藝，控制宿主細胞殘留核酸限度，以確保產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量已經(jīng)成為監(jiān)管機構(gòu)和行業(yè)內(nèi)關注的重點。

此外，《中華人民共和國藥典》2020年版第三部規(guī)定，外源性DNA殘留檢測采用DNA探針雜交法、熒光染色法和定量PCR法。目前市場上對宿主細胞殘留DNA檢測，主要采用熒光探針qPCR方法，qPCR法具有的靈敏度、序列特異性和準確性，可為生物制藥工業(yè)在工藝研究和成品質(zhì)量控制方面提供可靠的檢測手段，現(xiàn)也已成為各生物制品廠家檢測方法。

翌圣生物自主研發(fā)的CHO宿主細胞殘留DNA的qPCR法檢測試劑盒，可快速高效檢測生物藥中宿主DNA殘留量。

圖3. CHO DNA (3G)標曲范圍3fg/μL~300pg/μL，擴增效率為99.29%，各濃度檢測值CV<15%

除需對DNA的殘留量進行控制外，DNA殘留片段大小分布也是確定其相關風險因素的重要指標。有研究表明，一個功能基因至少在200bp以上，因此大于200bp可能會有一定的致病性，且殘留DNA片段越大，生物制品的風險等級越高。

美國FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)》的行業(yè)指南中建議將非致瘤性連續(xù)細胞的殘留DNA量限制在10 ng/劑以下，DNA大小限制在約200bp以下。

2022年5月，國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心（CDE）發(fā)布的體內(nèi)基因治療產(chǎn)品要學研究與評價技術(shù)指導原則（試行）中也明確指出需對DNA殘留量和殘留片段大小進行控制，建議盡量將DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。

目前，行業(yè)內(nèi)對于殘留宿主細胞DNA片段分析，主要是利用毛細管電泳的方法。研究者們開發(fā)了一種基于毛細管凝膠電泳與敏感激光誘導熒光（CGE-LIF）檢測殘留DNA分子大小的方法，可以檢測生物制品中殘留DNA的大小，實驗表明，大多數(shù)宿主細胞殘留DNA片段大小為50～2 000bp。除了毛細管電泳法外，實時熒光定量PCR（qPCR）法也被用于進行生物制品中生產(chǎn)用細胞相關的DNA片段分布的分析。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更簡單，耗時更短。

針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了CHO殘留DNA片段分析試劑盒，采用熒光探針qPCR法原理，設計了四種不同的擴增片段（94bp、115bp、252bp、505bp），用于定量檢測樣本中CHO宿主細胞殘留DNA片段的大小分布情況。

圖4. 宿主細胞中殘留DNA片段分析檢測流程圖

生物制品中HCP殘留含量通常被認為是產(chǎn)品的關鍵質(zhì)量屬性(CQA)，是工藝穩(wěn)健性監(jiān)測的重要評價指標，也是產(chǎn)品的重要質(zhì)控指標。各國法規(guī)都有涉及HCP的論述，要求必須對生物藥品進行分析和純化，以將宿主細胞蛋白HCP降低到可接受的水平。

《中國藥典》三部（2020版）規(guī)定：針對CHO細胞，HCP殘留需要<0.05%（相當于小于500ppm）；針對E.coli，HCP殘留需要<0.01%。

美國藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定：用一種靈敏度較高的方法檢測藥品中的HCP，其含量應該低于檢測限（通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCP含量應小于100ng，也即<0.01%）。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前HCP檢測常用的方法，在2020版《中國藥典》通則3412/3413/3414中提到的宿主蛋白殘留檢測方法均為ELISA法。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司自主研發(fā)了包括CHO宿主細胞在內(nèi)的多款HCP蛋白殘留量檢測試劑盒。試劑盒均采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）的實驗原理，以及生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)，能夠高靈敏的檢測樣本中HCP殘留量。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過程的優(yōu)化、中間工藝過程的雜質(zhì)控制以及終產(chǎn)品的放行檢測。

圖5. 翌圣CHO HCP ELISA試劑盒產(chǎn)品特點

金黃色葡萄球菌細胞壁中的A蛋白（Staphylococal ProteinA，SPA）又稱Protein A，是一種金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質(zhì)，42kDa，能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是IgG）的Fc區(qū)結(jié)合，通常在大規(guī)?？贵w制備中用于純化IgG。在抗體藥生產(chǎn)中，下游親和層析過程中Protein A會不可避免的與目標抗體蛋白一起被洗脫下來，從而在最終純化步驟中產(chǎn)生Protein A殘留。這種雜質(zhì)會嚴重影響產(chǎn)品質(zhì)量、藥效以及安全性。因此，國內(nèi)外法規(guī)對殘留Protein A檢測以及殘留量標準均有相關文件出臺。

《中華人民共和國藥典》2020年版第三部《人用重組單克隆抗體制品總論》3.2.4 工藝相關雜質(zhì)中提出“采用適宜的方法對供試品宿主蛋白質(zhì)、宿主細胞和載體DNA、蛋白A及其他工藝相關雜質(zhì)進行檢測”。

USP<130> PROTEIN A QUALITY ATTRIBUTES中提到希望廠家能夠在純化工藝中將脫落的protein A清除，生產(chǎn)工藝也需要進行相應驗證。

關于Protein A檢測方法和殘留限度，2020年版中國藥典三部《尼妥珠單抗注射液》3.1.3.3 蛋白質(zhì)A殘留量中提出“用酶聯(lián)免疫吸附法（通則3429）測定，蛋白質(zhì)A殘留量應不高于蛋白質(zhì)總量的0.001%”。

目前，基于ELISA的殘留檢測基本上已被應用于工藝研發(fā)和驗證過程中以確保在蛋白A親和層析之后的過程步驟中能夠有效去除殘留蛋白A。翌圣自主研發(fā)的Protein A ELISA Kit正是采用ELISA方法，通過試劑盒中的標準品對樣品中的殘留protein A進行定量檢測。

圖6. 翌圣生物ELISA法檢測Protein A殘留量的實驗過程