近日，陶氏化學(xué)與安捷倫基于 1290 UHPLC 系統(tǒng)合作開發(fā)了一種溶于二氯甲烷（DCM）中且濃度低至 ppb 級別的雙酚 A 及其二縮水甘油醚衍生物混合物檢測方法，該套設(shè)備采用了具有 feed 進(jìn)樣模式的 hybrid multisampler，在該進(jìn)樣模式下，樣品以一定的進(jìn)樣速度注入流動相中，因此暫時稀釋樣品，克服了溶劑效應(yīng)，同時進(jìn)樣量可高達(dá) 45 μL，這種新的進(jìn)樣方法顯著提高了目標(biāo)物質(zhì)的檢測限（>20×）。

本文選擇 DCM 制備的濃度為 10 ppm 的雙酚 A（BPA）和 6 種雙酚 A 二縮水甘油醚（BADGE）衍生物的混合物作為樣品，首先采用經(jīng)典流通式進(jìn)樣模式，發(fā)現(xiàn)不同進(jìn)樣量和梯度洗脫中等度保持的流動相初始比例差異會帶來明顯的色譜圖結(jié)果差異，見圖 1。

圖 1.（A）使用 FT 進(jìn)樣時，進(jìn)樣體積為 2 μL 至 10 μL 時的色譜圖比較。將等度保持設(shè)置為 10% B（深藍(lán)色）或 20% B（淺藍(lán)色）3 min，然后開始梯度，在 276 nm 處記錄 UV 吸收。（B）放大 3 倍的色譜圖，顯示峰 3 和 4 的分辨率。

圖 2. 樣品注入原理。(A) 流通式進(jìn)樣 FT；(B) Feed 進(jìn)樣 FI；流動相（橙色）的流向為從左往右，樣品（藍(lán)色）

該實(shí)驗中，作者對比了進(jìn)樣器不同設(shè)置下進(jìn)樣 10 μL 樣品所得的色譜圖。在圖 1 中，20% 高乙腈濃度與 FT 注射相結(jié)合時會導(dǎo)致所有峰的干擾，但從圖 3 中看到，當(dāng)采用 feed 進(jìn)樣模式，使用 1% feed 速度時，峰 2-7 峰形及分離度顯著改善。同時，從圖 3A 可以看出 feed 進(jìn)樣模式下 feed 速度的設(shè)置很關(guān)鍵，會直接影響色譜分離效果，對比 10% 乙腈的等度保持分離的色譜圖可以看出，進(jìn)料速度為 10% 的 feed 進(jìn)樣與 FT 進(jìn)樣相比顯然沒有優(yōu)勢。但是隨著 feed 速度從 10% 逐漸調(diào)整到 0.5% 時，化合物 2 的峰寬降低至 0.113 分鐘，同時，峰對（峰 3 和 4）和三重峰（峰 5-7）的分辨率顯著提高，如圖 3B 所示。進(jìn)料速度從 1% 降低到 0.5% 僅顯示出輕微的改善，同時注射持續(xù)時間加倍。因此，當(dāng)進(jìn)料速度為 1% 且在 10% 乙腈下保持等度時，可獲得最佳結(jié)果。

圖 3.（A）不同進(jìn)樣模式對分離性能的影響。在 10 μL 進(jìn)樣體積下，比較 FT 進(jìn)樣與 0.5-10% feed 速度下 FI 所得色譜圖。10 % B（暗跡線）或 20 % B（亮跡線）的等度保持設(shè)置為 3 min，在 276 nm 處記錄 UV 吸收。（B）放大 3 倍的色譜圖，顯示峰 3 和 4 的分辨率。

如上所述，F(xiàn)I 應(yīng)與足夠的捕獲條件相結(jié)合。需要考慮的另一點(diǎn)是梯度開始之前的等度保持持續(xù)時間。持續(xù)時間取決于進(jìn)樣量、recondition 溶劑量和 feed 速度，而 feed 速度又取決于 HPLC 泵的流速。為了減少等度保持持續(xù)時間并進(jìn)而縮短分析持續(xù)時間，最好選擇最高的進(jìn)料速度，同時保持所需的分離性能。當(dāng)液相泵的流速為 1.5 mL/min，20 μL 進(jìn)樣量下，進(jìn)料速度為 1% 時，進(jìn)樣時間為 1.3 分鐘。但對比圖 4 中 2-4 min 的等度保持時間下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)等度保留 2 min 時保留時間最短的化合物（峰 1）的峰不僅顯著變寬，而且相對于調(diào)整的時間軸提前 0.64 分鐘洗脫。為了揭示這種行為的原因，運(yùn)行了 DCM 溶劑空白（圖 4B 中的淺色軌跡），發(fā)現(xiàn) 2 min 等度保持時間下，DCM 與峰 1 共洗脫，很明顯，DCM 也保留在色譜柱上，因為其峰的前沿隨著等度保持時間的增加而延遲，因此等度保持時間要足夠長，只有這樣才能將 DCM 與目標(biāo)分析物分離。等度保持時間延長，梯度變化引起的基線下降與 DCM 峰前沿越來越近，這也很好說明了這一點(diǎn)。

圖 4. (A) 不同等度保持時間（圖中所示）對 1% 進(jìn)料速度（Vinj = 20 μL）FI 分離性能的影響。此外，還顯示了 5 μL FT 進(jìn)樣的 4 倍信號放大圖。每個樣品溶液色譜圖（深色）都疊加了 DCM-空白（淺色）。在 276 nm 處記錄 UV 吸收。(B) 227 nm 的波長下，并且未應(yīng)用時間軸調(diào)整或放大，其他條件與 (A) 相同。

當(dāng)進(jìn)樣速度為 1% 時，自動進(jìn)樣器的進(jìn)樣體積最大為 45 μL，無需手動調(diào)節(jié) recondition 溶劑體積。圖 5 比較了 feed 進(jìn)樣（45 μL）和 FT 進(jìn)樣（5 μL）下的色譜圖，對于關(guān)鍵峰對（峰 3 和 4）的分辨率，F(xiàn)I 顯示為 1.48，而 5 μL FT 注射產(chǎn)生的分辨率僅為 1.18。而將 feed 進(jìn)樣（45 μL）與 FT（2 μL）進(jìn)樣色譜圖進(jìn)行比較，在幾乎相同的分辨率下，F(xiàn)I 的注射量提高了 22.5 倍，也就是靈敏度可以提高 20 倍以上，這是一個實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)。在該優(yōu)化條件下，根據(jù) 10 ppm 樣品溶液峰高響應(yīng)及噪聲來粗略地估算檢測限，檢測限（LOD）范圍在 1-10 ppb 之間。

圖 5. 1% feed 速度下 FI 最大進(jìn)樣量（Vinj = 45 μL）和 FT 進(jìn)樣（Vinj = 5 μL）的色譜圖的比較。10% 乙腈等度保持 2 min，在 276 nm 處記錄 UV 吸收。