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MesenPlify™ 干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基技術(shù)資料（第四期）
本期主要內(nèi)容是分享冷凍保存后的hMSCs的如何復(fù)蘇，hMSCs的傳代培養(yǎng)具體的操作流程，成功復(fù)蘇后操作傳代培養(yǎng)，將hMSCs適應(yīng)到MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基，獲得最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
hMSCs復(fù)蘇傳代培養(yǎng)操作過程
冷凍保存的hMSCs的復(fù)蘇
1、將MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基提前恢復(fù)至室溫或37°C。
2、將hMSCs凍存管放置在37°C的水浴中迅速解凍，直到觀察到剩余的少量冰晶即將消失。
3、將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一個15或50mL錐形管中，緩慢地滴加10mL MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基，輕柔混勻。
4、以300xg的速度在室溫下離心5分鐘收集細(xì)胞。 5、棄去上清液以去除二甲基亞砜(DMSO)保護(hù)劑。
6、用1mL MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。
7、進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
（注意：如果細(xì)胞密度超過細(xì)胞計(jì)數(shù)器的推薦范圍，可能需要在培養(yǎng)基中進(jìn)一步稀釋樣品。）
8、按照較高的接種密度（5,000-7,000/cm2）將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)容器中，使用MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基補(bǔ)充至適當(dāng)體積。
（TIPS：當(dāng)細(xì)胞剛從凍存中復(fù)蘇時，建議使用高的接種密度）
9、在37°C、5% CO?和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。
10、每隔3-4天使用預(yù)熱至37°C的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基進(jìn)行換液，或傳代（當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70-80%時，具體操作步驟可參考下文“hMSCs的傳代培養(yǎng)”）。
hMSCs的傳代培養(yǎng)
1、檢查hMSCs是否達(dá)到70-80%的匯合度。注意不要讓hMSCs達(dá)到100%的匯合度，否則細(xì)胞可能會出現(xiàn)分化的跡象。
2、將MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基提前恢復(fù)至室溫或37°C。
3、用10mL的不含Ca++、不含Mg++的DPBS（不包含在套裝中）輕輕洗滌細(xì)胞一次。
4、添加復(fù)溫的0.125%胰蛋白酶消化液（稀釋為0.5x使用）或重組胰蛋白酶消化液TrypLE（1×）（不包含在套裝中），以覆蓋整個組織培養(yǎng)瓶的表面。
5、輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶均勻分布在表面上。
6、放在37°C培養(yǎng)箱中2-7分鐘。 （TIPS：初次使用 MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基應(yīng)摸索合適的消化時間，若細(xì)胞剛從FBS培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)過來，可能需要5-7分鐘。若細(xì)胞已適應(yīng)無血清培養(yǎng)，消化時間可能縮短至2-4分鐘。 細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中較容易消化脫落，此為正常現(xiàn)象，應(yīng)注意避免消化過度的情況發(fā)生，推薦使用重組胰蛋白酶消化液 TrypLE（1×），若采用胰蛋白酶消化液，可稀釋到 0.125%（0.5x）使用）。
7、使用相差顯微鏡檢查細(xì)胞是否已脫落，輕輕敲擊培養(yǎng)瓶的側(cè)面以幫助脫落。
8、一旦細(xì)胞脫落并自由漂浮，將MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基添加到消化液體積的3倍，以終止消化。
9、將細(xì)胞懸液收集到一個50mL錐形管中。
10、以300xg的速度在室溫下離心5分鐘。
11、棄去上清液以去除胰蛋白酶。
12、用1mL MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。
13、進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。（TIPS：如果細(xì)胞密度超過細(xì)胞計(jì)數(shù)器的推薦范圍，可能需要在培養(yǎng)基中進(jìn)一步稀釋樣品。）
14、計(jì)算所需的培養(yǎng)基體積，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要或視細(xì)胞狀態(tài)，以常規(guī)的接種密度（3000-5000/cm2）或較高接種密度（5000-7000/cm2）將細(xì)胞接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中。
15、使用MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基補(bǔ)充至適當(dāng)體積（可參考下表）。
16、在37°C、5% CO?和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。
17、每隔3-4天使用預(yù)熱至37°C的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基進(jìn)行換液，或傳代（當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70-80%時）。
hMSC傳代和培養(yǎng)操作推薦用量:
hMSCs的冷凍保存
1、通過添加20%二甲基亞砜（DMSO，套裝中未提供）制備2x的冷凍保存液。
（TIPS：假設(shè)最終需要的細(xì)胞凍存體積為1mL，先準(zhǔn)備500uL的2x冷凍保存液，配制方法是將100uL的100% DMSO加入到400uL的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基中）
2、將細(xì)胞復(fù)溫至室溫的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基中懸浮，使細(xì)胞的濃度為常規(guī)細(xì)胞濃度的兩倍（例如2x106/mL）。
3、將步驟1中制備的2x冷凍保存液，以1:1的體積，緩慢地滴加到細(xì)胞懸浮液中，然后用移液管輕輕混合。（此時，冷凍液的濃度被稀釋為1x，即DMSO的最終濃度為10%，細(xì)胞濃度為1x106/mL）
4、將混合好的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到預(yù)冷到2- 8°C的細(xì)胞凍存管中。
5、轉(zhuǎn)入梯度降溫盒，-80℃過夜，隔天轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
（TIPS：也可以購買其他商品化的hMSCs冷凍保存液進(jìn)行凍存，操作步驟參見其說明書進(jìn)行）
hMSC的特性分析
可以使用流式細(xì)胞術(shù)、集落形成單位（CFU）分析以及多向分化分析對培養(yǎng)的hMSCs進(jìn)行特性分析。 詳情請參考指南手冊獲取信息(Guide Book: Human Mesenchymal Stem Cells)。
將hMSC適應(yīng)到MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基的過程
如果正在使用其他品牌培養(yǎng)基，可以直接切換到MesenPlifyTM sXF體系，一般情況下無需進(jìn)行預(yù)處理。當(dāng)細(xì)胞剛從凍存中復(fù)蘇時，也可先用原培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇，隨后在Day1更換為MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基，后續(xù)即可正常使用MesenPlifyTM sXF基培養(yǎng)或傳代
將hMSC適應(yīng)到MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基的過程
僅供研究使用（RUO），或用于進(jìn)一步制造。
不適用于人類或動物診斷或治療用途。
產(chǎn)品按照ISO 13408和ISO 9001相關(guān)的質(zhì)量管理體系進(jìn)行制造。
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