一、引言

二、多聚賴氨酸硅納米粒子的制備

（一）材料與儀器

1. 材料
   硅源（如正硅酸乙酯等）、多聚賴氨酸（不同分子量）、氨水（作為催化劑）、無(wú)水乙醇等有機(jī)溶劑、去離子水。同時(shí)準(zhǔn)備用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的核酸（如質(zhì)粒 DNA）。

2. 儀器
   磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）、動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS）、傅里葉變換紅外光譜儀（FT - IR）等。

（二）制備方法

1. 硅納米粒子的合成
   在典型的合成過(guò)程中，將硅源（如正硅酸乙酯）溶解在無(wú)水乙醇和去離子水的混合溶液中，加入適量的氨水作為催化劑。在磁力攪拌下，反應(yīng)在一定溫度（如 30 - 50°C）下持續(xù)數(shù)小時(shí)。反應(yīng)完成后，通過(guò)離心收集硅納米粒子，并用乙醇和水多次洗滌以去除雜質(zhì)。

2. 多聚賴氨酸的修飾
   將合成的硅納米粒子分散在含有多聚賴氨酸的溶液中。通過(guò)靜電作用或化學(xué)鍵合（如硅烷偶聯(lián)劑介導(dǎo)）的方式使多聚賴氨酸附著在硅納米粒子表面。例如，當(dāng)使用靜電作用時(shí)，硅納米粒子表面帶負(fù)電，多聚賴氨酸在合適的 pH 條件下帶正電，二者相互吸引。反應(yīng)在溫和的條件下進(jìn)行一段時(shí)間（如 2 - 4 小時(shí)），然后通過(guò)離心等方法分離得到多聚賴氨酸硅納米粒子。

三、多聚賴氨酸硅納米粒子的表征

（一）形態(tài)學(xué)表征

1. 掃描電子顯微鏡（SEM）
   將多聚賴氨酸硅納米粒子樣品分散在合適的溶劑中，滴在硅片上干燥后進(jìn)行 SEM 觀察?？梢钥吹郊{米粒子的大小、形狀和表面形貌。結(jié)果顯示制備的納米粒子呈現(xiàn)出較為規(guī)則的球形，粒徑分布在一定范圍內(nèi)（如 50 - 200nm）。

2. 透射電子顯微鏡（TEM）
   TEM 可以提供更詳細(xì)的納米粒子內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息。通過(guò) TEM 觀察到多聚賴氨酸在硅納米粒子表面形成了一層均勻的包覆層，進(jìn)一步證實(shí)了修飾的成功。

（二）粒徑與電位分析

1. 動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS）
   使用 DLS 測(cè)量多聚賴氨酸硅納米粒子在溶液中的粒徑分布和 Zeta 電位。結(jié)果表明，納米粒子具有較窄的粒徑分布，且 Zeta 電位呈正電性，這有利于與帶負(fù)電的核酸結(jié)合。

2. 傅里葉變換紅外光譜儀（FT - IR）
   FT - IR 分析可以檢測(cè)多聚賴氨酸硅納米粒子中的化學(xué)鍵變化。在光譜中可以觀察到硅 - 氧鍵的特征峰以及多聚賴氨酸中氨基等官能團(tuán)的峰，同時(shí)可以看到修飾前后峰的變化，證明多聚賴氨酸與硅納米粒子的結(jié)合。

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

1. 細(xì)胞系選擇
   選擇多種常用的細(xì)胞系，如 HeLa 細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞系）、293T 細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞系）等。這些細(xì)胞系在基因轉(zhuǎn)染研究中具有代表性，其生長(zhǎng)特性和對(duì)載體的反應(yīng)不同。

2. 培養(yǎng)條件
   將細(xì)胞培養(yǎng)在含有適當(dāng)血清（如 10% 胎牛血清）和抗生素（如青霉素 - 鏈霉素）的培養(yǎng)基（如 DMEM 培養(yǎng)基）中，在 37°C、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合適的密度（如 70 - 80% 融合度）時(shí)，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

（二）轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)方法

1. 納米粒子 - 核酸復(fù)合物的制備
   將多聚賴氨酸硅納米粒子與核酸（如質(zhì)粒 DNA）在一定比例下混合在無(wú)血清培養(yǎng)基中，輕輕攪拌或振蕩使其充分結(jié)合形成復(fù)合物。通過(guò)改變納米粒子與核酸的質(zhì)量比、孵育時(shí)間等條件來(lái)優(yōu)化復(fù)合物的形成。

2. 轉(zhuǎn)染操作
   將制備好的復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞上，在 37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間（如 2 - 4 小時(shí)）。然后更換為含有血清的完整培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)組，包括不同納米粒子濃度、不同細(xì)胞系等，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（如使用商業(yè)化的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑）和陰性對(duì)照組（只加細(xì)胞和培養(yǎng)基）。

（三）轉(zhuǎn)染效率評(píng)估

1. 熒光顯微鏡觀察
   當(dāng)使用帶有熒光標(biāo)記的核酸（如綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒 DNA）時(shí)，可以在轉(zhuǎn)染一定時(shí)間后（如 24 - 48 小時(shí)）通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。統(tǒng)計(jì)熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例來(lái)初步評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示多聚賴氨酸硅納米粒子在一定條件下能夠有效地將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，不同細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染效率有所差異。

2. 流式細(xì)胞術(shù)分析
   進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行定量分析。通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記核酸在細(xì)胞中的表達(dá)情況，可以更準(zhǔn)確地計(jì)算出轉(zhuǎn)染效率。與熒光顯微鏡觀察結(jié)果相印證，得到不同實(shí)驗(yàn)組的準(zhǔn)確轉(zhuǎn)染效率數(shù)據(jù)。

（四）細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

1. MTT 法
   在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（如 24、48、72 小時(shí)），采用 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力。將 MTT 試劑加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，在細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶的作用下，MTT 被還原為紫色的甲瓚結(jié)晶。通過(guò)溶解甲瓚結(jié)晶并測(cè)量其在特定波長(zhǎng)下的吸光度，可以反映細(xì)胞的活力。結(jié)果表明多聚賴氨酸硅納米粒子在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞的毒性較低，具有較好的生物相容性。

2. LDH 釋放實(shí)驗(yàn)
   同時(shí)進(jìn)行乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，LDH 會(huì)釋放到細(xì)胞外。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性，可以評(píng)估細(xì)胞的損傷程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了多聚賴氨酸硅納米粒子在轉(zhuǎn)染過(guò)程中的低細(xì)胞毒性。

五、結(jié)果與討論

（一）制備條件對(duì)納米粒子性能的影響

1. 硅納米粒子合成條件的影響
   硅源濃度、氨水用量、反應(yīng)溫度和時(shí)間等因素對(duì)硅納米粒子的粒徑和分散性有顯著影響。例如，增加硅源濃度可能導(dǎo)致粒徑增大，而合適的氨水用量有助于控制粒子的生長(zhǎng)速度和粒徑均勻性。通過(guò)優(yōu)化這些條件，可以制備出粒徑合適、分散性良好的硅納米粒子，為后續(xù)多聚賴氨酸修飾提供良好的基礎(chǔ)。

2. 多聚賴氨酸修飾條件的影響
   多聚賴氨酸的分子量、濃度以及修飾反應(yīng)的時(shí)間和溫度等對(duì)多聚賴氨酸硅納米粒子的性能也至關(guān)重要。較高分子量的多聚賴氨酸可能在納米粒子表面形成更厚的包覆層，但可能會(huì)影響納米粒子的分散性。合適的修飾條件可以使納米粒子具有良好的正電性和穩(wěn)定性，有利于與核酸結(jié)合。

（二）細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與影響因素

1. 納米粒子 - 核酸比例的影響
   不同的納米粒子與核酸質(zhì)量比會(huì)影響復(fù)合物的形成和轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)納米粒子過(guò)量時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞攝取困難，而核酸過(guò)量則可能使復(fù)合物不穩(wěn)定。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最佳的比例范圍，可以提高轉(zhuǎn)染效率。

2. 細(xì)胞系特異性
   不同細(xì)胞系對(duì)多聚賴氨酸硅納米粒子的攝取和轉(zhuǎn)染效率不同。這可能與細(xì)胞表面受體、細(xì)胞膜通透性等細(xì)胞特性有關(guān)。例如，HeLa 細(xì)胞和 293T 細(xì)胞在相同轉(zhuǎn)染條件下轉(zhuǎn)染效率存在差異，這為針對(duì)不同細(xì)胞類型的基因治療應(yīng)用提供了參考。

（三）細(xì)胞毒性與安全性評(píng)估

六、結(jié)論