一、引言

二、核酸雜交技術(shù)原理

（一）Southern 雜交

（二）Northern 雜交

（三）原位雜交

三、核酸雜交技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用

（一）環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)分析

1. 群落組成多樣性評估
   利用核酸雜交技術(shù)可以設(shè)計針對不同微生物類群的通用探針或特異性探針，對環(huán)境樣品中的總核酸進(jìn)行雜交分析。通過檢測多種探針的雜交信號，可以了解環(huán)境微生物群落中不同微生物類群的相對豐度和分布情況，從而評估群落的組成多樣性。例如，針對細(xì)菌的 16S rRNA 基因設(shè)計一系列特異性探針，可以區(qū)分不同門、綱、目、科、屬的細(xì)菌在環(huán)境樣品中的存在情況，構(gòu)建微生物群落的組成圖譜。

2. 群落動態(tài)變化監(jiān)測
   在環(huán)境受到污染、氣候變化或生態(tài)修復(fù)等過程中，環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)會發(fā)生相應(yīng)的變化。通過定期采集環(huán)境樣品，采用核酸雜交技術(shù)對特定微生物類群或功能基因進(jìn)行檢測，可以實時監(jiān)測微生物群落的動態(tài)變化過程。例如，在土壤污染修復(fù)過程中，利用針對降解特定污染物的微生物功能基因探針進(jìn)行雜交分析，觀察隨著修復(fù)時間的推移，具有該功能基因的微生物種群豐度的變化，評估修復(fù)措施對微生物群落的影響以及修復(fù)效果。

（二）特定微生物種群檢測

1. 致病微生物檢測
   在環(huán)境微生物研究中，對環(huán)境中的致病微生物進(jìn)行檢測具有重要意義，如飲用水源中的病原體檢測。核酸雜交技術(shù)可設(shè)計針對致病微生物特異性基因序列的探針，快速、靈敏地檢測環(huán)境樣品中是否存在致病微生物及其數(shù)量。例如，針對大腸桿菌 O157:H7 的特定毒力基因設(shè)計核酸探針，通過雜交反應(yīng)可以在復(fù)雜的水樣中準(zhǔn)確檢測出該致病菌株的存在，為保障飲用水安全提供技術(shù)支持。

2. 稀有微生物種群鑒定
   環(huán)境中存在許多豐度極低但具有特殊生態(tài)功能或潛在應(yīng)用價值的稀有微生物種群。核酸雜交技術(shù)的高靈敏度使其能夠在大量背景微生物存在的情況下檢測到這些稀有微生物。例如，在深海熱泉環(huán)境中，利用針對某些嗜熱微生物更好基因序列的探針進(jìn)行原位雜交，可以發(fā)現(xiàn)和鑒定那些難以通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離得到的稀有微生物，有助于深入了解環(huán)境微生物資源。

（三）微生物功能基因研究

1. 功能基因的篩選與鑒定
   環(huán)境微生物蘊含著豐富的功能基因資源，這些基因參與了各種生物地球化學(xué)循環(huán)過程，如氮循環(huán)、碳循環(huán)等。核酸雜交技術(shù)可用于從環(huán)境樣品中篩選和鑒定具有特定功能的基因。通過設(shè)計與目標(biāo)功能基因序列互補的探針，與環(huán)境樣品中的總 DNA 或 cDNA 文庫進(jìn)行雜交，可以快速定位和鑒定感興趣的功能基因。例如，針對參與氮固定過程的固氮酶基因設(shè)計探針，在土壤微生物基因組文庫中進(jìn)行雜交篩選，能夠發(fā)現(xiàn)新的固氮微生物及其固氮基因序列。

2. 功能基因表達(dá)調(diào)控研究
   除了檢測功能基因的存在，核酸雜交技術(shù)還可用于研究微生物功能基因的表達(dá)調(diào)控。Northern 雜交可以直接檢測環(huán)境微生物在不同環(huán)境條件下特定功能基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，從而揭示微生物基因表達(dá)與環(huán)境因素之間的關(guān)系。例如，研究在不同溫度、營養(yǎng)物質(zhì)濃度等條件下，微生物參與有機物降解基因的表達(dá)調(diào)控機制，有助于深入理解微生物對環(huán)境變化的適應(yīng)策略以及優(yōu)化生物修復(fù)過程中的微生物活性調(diào)控。

（四）微生物與環(huán)境相互作用研究

1. 微生物與植物根系相互作用
   在植物根系周圍存在著復(fù)雜的根際微生物群落，這些微生物與植物之間存在著密切的相互作用，如促進(jìn)植物生長、提高植物抗逆性等。核酸雜交技術(shù)可用于研究根際微生物群落中與植物相互作用相關(guān)的微生物種群及其功能基因。例如，設(shè)計針對能夠產(chǎn)生植物生長激素或具有生物防治功能的微生物基因探針，通過對根際土壤樣品進(jìn)行雜交分析，了解這些有益微生物在根際的分布和豐度變化，以及它們與植物根系分泌物、土壤養(yǎng)分等環(huán)境因素之間的相互關(guān)系，為開發(fā)高效的微生物肥料和生物防治劑提供理論依據(jù)。

2. 微生物與污染物相互作用
   在污染環(huán)境中，微生物與污染物之間的相互作用決定了污染物的降解轉(zhuǎn)化過程。核酸雜交技術(shù)可用于研究參與污染物降解的微生物種群及其功能基因在污染環(huán)境中的表達(dá)和調(diào)控。例如，在石油污染土壤中，針對石油烴降解基因設(shè)計探針，分析在不同污染程度、不同修復(fù)階段下，具有降解功能的微生物種群豐度和基因表達(dá)水平的變化，揭示微生物對石油污染物的降解機制以及環(huán)境因素對降解過程的影響，為優(yōu)化石油污染土壤修復(fù)技術(shù)提供數(shù)據(jù)支持。

四、基于核酸雜交技術(shù)的環(huán)境微生物研究實驗流程示例

（一）實驗材料準(zhǔn)備

1. 環(huán)境樣品采集
   根據(jù)研究目的，選擇合適的環(huán)境樣品采集地點和方法。例如，采集土壤樣品時，可使用無菌采樣器在不同深度、不同植被覆蓋區(qū)域采集多個樣本，將采集的土壤樣品混合均勻后裝入無菌袋中，迅速帶回實驗室進(jìn)行處理。對于水樣采集，可使用經(jīng)過滅菌處理的采樣瓶在水體不同深度、不同位置采集水樣，采樣后盡快進(jìn)行過濾或其他預(yù)處理以濃縮微生物。

2. 試劑與儀器
   準(zhǔn)備用于核酸提取、純化、雜交反應(yīng)及檢測的各種試劑，如 DNA 提取試劑盒、RNA 提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、DNA 聚合酶、核酸探針標(biāo)記試劑盒、雜交緩沖液、洗滌緩沖液等。同時，準(zhǔn)備實驗所需的儀器設(shè)備，包括離心機、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、核酸雜交箱、熒光顯微鏡（用于熒光原位雜交檢測）、放射性檢測儀（用于放射性同位素標(biāo)記探針檢測）等。

（二）核酸提取與純化

1. DNA 提取
   根據(jù)環(huán)境樣品的性質(zhì)選擇合適的 DNA 提取方法。對于土壤樣品，可采用酚 - 氯仿抽提法或商業(yè) DNA 提取試劑盒。以酚 - 氯仿抽提法為例，首先將土壤樣品與提取緩沖液混合，加入蛋白酶 K 進(jìn)行裂解，然后依次加入酚、氯仿進(jìn)行抽提，去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，最后通過乙醇沉淀法回收 DNA。提取得到的 DNA 用適量的 TE 緩沖液溶解，并通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度。

2. RNA 提取
   對于需要進(jìn)行 Northern 雜交檢測 RNA 的實驗，采用 RNA 提取試劑盒進(jìn)行 RNA 提取。按照試劑盒說明書操作，在提取過程中要注意防止 RNA 酶的污染，可使用 DEPC 處理水和 RNase - free 的耗材。提取后的 RNA 同樣通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其完整性和濃度。

（三）核酸雜交實驗操作

1. Southern 雜交
   （1）DNA 酶切與電泳
   將提取的環(huán)境樣品 DNA 用合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切體系根據(jù)酶的說明書進(jìn)行配制，在適宜溫度下孵育一定時間。酶切完成后，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件根據(jù) DNA 片段大小進(jìn)行設(shè)置，一般采用低電壓長時間電泳，以確保 DNA 片段充分分離。
   （2）轉(zhuǎn)膜
   電泳結(jié)束后，采用堿變性法將凝膠中的 DNA 片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。將尼龍膜放在凝膠上方，依次鋪上濾紙、吸水紙等，通過毛細(xì)作用將 DNA 轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移過程中要注意避免氣泡產(chǎn)生，確保轉(zhuǎn)移效率。轉(zhuǎn)移完成后，將膜在 80°C 下烘烤固定一定時間。
   （3）探針標(biāo)記與雜交
   采用放射性同位素（如 32P）或非放射性標(biāo)記物對核酸探針進(jìn)行標(biāo)記。按照標(biāo)記試劑盒說明書進(jìn)行操作。標(biāo)記好的探針與尼龍膜上的 DNA 片段在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交溫度和時間根據(jù)探針和目標(biāo)序列的特性進(jìn)行優(yōu)化，一般在 42°C - 65°C 下雜交過夜。
   （4）洗膜與檢測
   雜交完成后，依次用不同濃度的洗滌緩沖液在適宜溫度下洗膜，去除未雜交的探針。對于標(biāo)記的探針，采用抗抗體與雜交體結(jié)合，然后通過化學(xué)顯色反應(yīng)進(jìn)行檢測，在膜上出現(xiàn)有色條帶的位置即為目標(biāo) DNA 序列所在位置，通過條帶的強度可大致判斷目標(biāo)序列的豐度。對于放射性同位素標(biāo)記的探針，則通過放射自顯影檢測雜交信號。
2. Northern 雜交
   （1）RNA 變性電泳
   將提取的 RNA 樣品與甲醛變性劑混合，在 65°C 下變性一定時間后迅速置于冰上冷卻。然后將變性后的 RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳過程中使用甲醛變性瓊脂糖凝膠和 MOPS 緩沖液，電泳條件根據(jù) RNA 大小進(jìn)行設(shè)置。
   （2）轉(zhuǎn)膜與固定
   電泳結(jié)束后，將 RNA 轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，轉(zhuǎn)膜方法與 Southern 雜交類似，但轉(zhuǎn)膜過程中要注意保持 RNA 的變性狀態(tài)。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜在紫外交聯(lián)儀上進(jìn)行交聯(lián)固定或在 80°C 下烘烤固定。
   （3）探針雜交與檢測
   與 Southern 雜交中的探針雜交和檢測步驟基本相同，但由于 RNA 的穩(wěn)定性較差，雜交和洗膜條件要更加溫和，以避免 RNA 的降解。
3. 原位雜交
   （1）樣品固定與處理
   將采集的環(huán)境樣品（如組織切片或細(xì)胞涂片）用固定劑（如 4% 多聚甲醛）固定一定時間，然后進(jìn)行通透處理，可使用蛋白酶 K 或 Triton X - 100 等試劑，使細(xì)胞通透性增加，便于探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
   （2）探針雜交
   將標(biāo)記有熒光物質(zhì)（如 FITC、Cy3 等）的核酸探針與處理后的樣品在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交溫度和時間根據(jù)探針和樣品的特性進(jìn)行優(yōu)化，一般在 37°C - 50°C 下雜交 1 - 3 小時。
   （3）洗膜與觀察
   雜交完成后，用洗滌緩沖液洗去未結(jié)合的探針，然后在熒光顯微鏡下觀察樣品，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)熒光信號的位置即為目標(biāo)核酸所在位置，通過熒光強度可大致判斷目標(biāo)核酸的豐度和分布情況。

五、核酸雜交技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的未來發(fā)展趨勢