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DNA聚合酶是PCR反應(yīng)的核心組分，廣泛應(yīng)用于生物及醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。對(duì)于普通PCR，常規(guī)熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）即可滿足需求。但對(duì)于高通量測(cè)序，擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性非常關(guān)鍵，優(yōu)選高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增。常規(guī)的高保真擴(kuò)增酶無法讀取和擴(kuò)增含有尿嘧啶和次黃嘌呤的模板，翌圣生物通過定向改造，推出Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase，該聚合酶可兼容含U堿基模板和常規(guī)模板，擴(kuò)增效率高保真性好，而且酶本身各項(xiàng)殘留均很低，滿足多種應(yīng)用方向的擴(kuò)增需求。
哪些應(yīng)用方向可優(yōu)選Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase呢？
重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化/酶法轉(zhuǎn)化的DNA擴(kuò)增-甲基化研究
DNA甲基化測(cè)序是研究生物體內(nèi)基因調(diào)控的重要技術(shù)手段，越來越多地應(yīng)用于腫瘤早篩、診斷等技術(shù)中。全基因組重亞硫酸氫鹽測(cè)序（WGBS）是甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，在WGBS文庫構(gòu)建過程中，樣本DNA經(jīng)重亞硫酸氫鹽處理后，非甲基化的胞嘧啶（C）會(huì)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），甲基化的C則保持不變。在后續(xù)PCR擴(kuò)增中U會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），但常規(guī)高保真酶不能以含有dUTP的DNA作為擴(kuò)增模板，因此需要經(jīng)過特殊改造耐受dUTP的酶，從而應(yīng)用到甲基化文庫構(gòu)建或者定點(diǎn)突變等技術(shù)中。
DNA甲基化建庫常用到兩種建庫方法，甲基化單鏈建庫和甲基化雙鏈建庫，單鏈建庫技術(shù)主要針對(duì)BS轉(zhuǎn)化處理后的單鏈及損傷DNA進(jìn)行利用和轉(zhuǎn)化，步驟包括甲基化轉(zhuǎn)化（使未甲基化的C轉(zhuǎn)化為U）、變性（雙鏈DNA變性為單鏈DNA）、3’接頭連接、二鏈合成以及文庫擴(kuò)增。甲基化雙鏈建庫則通常是在DNA轉(zhuǎn)化之前或之后進(jìn)行文庫構(gòu)建，涉及連接甲基化接頭、經(jīng)亞硫酸氫鹽或酶法轉(zhuǎn)化處理，再經(jīng)過一步擴(kuò)增即可構(gòu)建針對(duì)特定測(cè)序平臺(tái)的甲基化文庫。這兩種建庫的文庫擴(kuò)增都需要用到Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase。
圖1.雙鏈甲基化建庫文庫流程
受損FFPE DNA樣本的擴(kuò)增-腫瘤領(lǐng)域
福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE) 的組織樣本是世界各地病理實(shí)驗(yàn)室保存臨床組織樣本的標(biāo)準(zhǔn)方法。隨著核酸測(cè)序技術(shù)的發(fā)展引起了人們對(duì)使用生物庫中存儲(chǔ)的歷史FFPE樣本的興趣。然而，福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本在制備過程中會(huì)對(duì)DNA造成顯著損傷，這些損傷包括：DNA分子鏈斷裂，DNA高度片段化、核酸與蛋白質(zhì)交聯(lián)、胞嘧啶脫氨基，即FFPE樣本中的胞嘧啶（C）可能脫氨基變成尿嘧啶（U）、氧化損傷、DNA的3'端被封閉、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)。這些損傷會(huì)導(dǎo)致從FFPE樣本中提取的DNA質(zhì)量較差，從而影響下游應(yīng)用，如PCR擴(kuò)增、測(cè)序等。
為了解決這些問題，一種方法是采用修復(fù)試劑盒，如Hieff NGS® FFPE DNA Repair Reagent（Cat#12606），另一種方法是采用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase對(duì)含有尿嘧啶的受損DNA模板中進(jìn)行高保真擴(kuò)增。
圖2.耐U高保真聚合酶擴(kuò)增受損的DNA模板
防止擴(kuò)增子的氣溶膠污染-病原領(lǐng)域
PCR技術(shù)使生命科學(xué)領(lǐng)域和研究手段發(fā)生了革命性的變化，與DNA克隆、DNA重組、DNA測(cè)序、RNA干擾等分子生物學(xué)技術(shù)一樣，成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)研究領(lǐng)域乃至臨床疾病診斷的工具。但是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，是PCR反應(yīng)中最主要的污染問題，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013copies/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)拷貝的上限，所以極微量的PCR產(chǎn)物氣溶膠，就可能造成假陽性。對(duì)于qPCR、RT-qPCR的擴(kuò)增酶為Taq酶，Taq酶具有耐U的功能，常搭配UDG酶一起使用，Taq酶不具有高保真性，在一些需要保真度高的應(yīng)用中Taq酶就無法勝任，如針對(duì)病原基因組的擴(kuò)增測(cè)序，此時(shí)需要采用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase搭配UDG酶進(jìn)行防污染的高保真擴(kuò)增。UDG 酶即可將反應(yīng)體系中已有的dU的DNA污染物中的尿嘧啶堿基降解，并在隨后變性這步的條件下 DNA 鏈斷裂，消除由于污染DNA產(chǎn)生的擴(kuò)增，從而保證擴(kuò)增結(jié)果的特異性，準(zhǔn)確性。
圖3.多重?cái)U(kuò)增體系中防污染原理
基于尿嘧啶切除的克隆
基于尿嘧啶切除的克隆依賴于含有重疊序列的PCR產(chǎn)物進(jìn)行無縫組裝，不需要依賴限制性內(nèi)切酶和連接酶，可用于多個(gè)PCR片段的組裝、核苷酸序列的修改以及定向克隆。具體操作流程為：
PCR引物5′端具有重疊序列，包含一個(gè)dU堿基，該堿基在與5′末端6- 10 nt距離處取代dT；
通過使用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase進(jìn)行PCR，在目標(biāo)DNA分子和克隆載體之間生成6-10個(gè)堿基的同源性片段，并且每個(gè)PCR產(chǎn)物的5'端被引入了一個(gè)dU；
使用Uracil-Specific Excision Reagent處理PCR片段，在每個(gè)dU位置形成單核苷酸缺口，產(chǎn)生適合于PCR片段定向組裝的3′單鏈延伸；
退火延伸完成組裝。
圖4.基于尿嘧啶切除的克隆示意圖
以上這些應(yīng)用展示了Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase在分子生物學(xué)研究中的多功能性和高效性，使其成為實(shí)驗(yàn)室中的工具之一。
Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase不僅應(yīng)用領(lǐng)域廣，而且性能優(yōu)異，圖5中展示了Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase高擴(kuò)增效率和低殘留。
圖5.Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase高擴(kuò)增效率和低殘留
產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品應(yīng)用 |
Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase mix Hieff Canace®耐U+高保真DNA聚合酶混合液 | 12928ES | 耐U高保真擴(kuò)增 |
熱敏UDG含甘油Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG),heat-labile,1 U/μL | 10303ES | PCR防污染 |
Uracil-Specific Excision Reagent (1 U/μL) | 14537ES | 基于尿嘧啶切除的克隆 |
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