病毒是一種由核酸分子和蛋白質(zhì)構(gòu)成的非細胞形態(tài)生物，能夠攜帶基因進入受體細胞，經(jīng)開發(fā)和改造后可用作細胞基因治療(CGT)載體。通過改造后的病毒載體一般具有更好的安全性和更快的分子克隆速度，同時感染能力也得到了定向進化，從而具備了更快捷、更廣譜的轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，以及更安全、更特異的感染特性。然而由于病毒的多樣性及宿主機體的高度復(fù)雜性，目前僅腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和溶瘤病毒等少數(shù)種類可改造為CGT載體。

其中，逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）又稱反轉(zhuǎn)錄病毒，是一種RNA病毒，病毒顆粒為二十面體對稱結(jié)構(gòu)、球形，有包膜，表面有刺突。逆轉(zhuǎn)錄病毒需在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，新合成的cDNA插入宿主的核DNA中，隨宿主DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯達到擴增目的。

按照目前國際病毒分類標準，逆轉(zhuǎn)錄病毒科分為7個屬：α逆轉(zhuǎn)錄病毒屬、β逆轉(zhuǎn)錄病毒屬、γ反轉(zhuǎn)錄病毒屬、δ反轉(zhuǎn)錄病毒屬、ε反轉(zhuǎn)錄病毒屬、慢病毒屬和泡沫病毒屬。在這些逆轉(zhuǎn)錄病毒中，僅γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒用于臨床。

因此，通常所說的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是指在γ逆轉(zhuǎn)錄病毒（GRV）的基礎(chǔ)上改造獲得的，主要包括MMLV（莫洛尼氏鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒）和MSCV（鼠干細胞病毒）。這些載體能夠?qū)⑼庠椿蛴行У卣系剿拗骷毎幕蚪M中，實現(xiàn)長期穩(wěn)定的基因表達。

γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有簡單的基因組結(jié)構(gòu)，由以下蛋白質(zhì)編碼基因組成：gag、pol和env。Gag編碼衣殼蛋白，Pol編碼病毒酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶)，Env編碼囊膜蛋白。

圖1. 基于小鼠白血病病毒(MLV)的γ逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的結(jié)構(gòu)(doi：10.3390/v3060677)

γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝系統(tǒng)通常包括三個關(guān)鍵的質(zhì)粒：包裝質(zhì)粒（含有γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag、pol和rev基因）、載體質(zhì)粒（包含目的基因、選擇標記基因以及必要的病毒序列）和包膜質(zhì)粒（含病毒粒子的表面蛋白，如env基因）。

γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的生產(chǎn)平臺主要有兩種：一種是瞬時工藝，采用上述三質(zhì)粒系統(tǒng)，共轉(zhuǎn)染到HEK293T包裝細胞系中，進行病毒制備；另外一種是穩(wěn)定工藝，即以表達包裝和囊膜基因的包裝細胞系制備穩(wěn)定產(chǎn)毒細胞株（如PG13）。

通常，通過改造將逆轉(zhuǎn)錄病毒中與病毒包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因刪除，替換為需要表達的外源基因，因此生產(chǎn)的病毒顆粒是復(fù)制缺陷型的，無法在細胞內(nèi)復(fù)制并組裝為新的病毒顆粒，但能將外源基因整合到宿主基因組中持續(xù)表達。

目前制備CAR-T細胞所用的慢病毒和γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體均為復(fù)制缺陷型，已極大降低了產(chǎn)生復(fù)制型病毒的風(fēng)險，但病毒載體的制備方法以及制備過程中仍存在產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒或復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒的潛在風(fēng)險。這些風(fēng)險主要源自：病毒載體生產(chǎn)過程中，因穿梭質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒及包裝細胞(eg.HEK293/HEK293T)中的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄元件之間發(fā)生的同源或非同源重組；慢病毒載體與T細胞的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄元件之間發(fā)生的同源或非同源重組。

因此，復(fù)制型病毒（RCV）可能在病毒載體生產(chǎn)階段、CAR-T細胞制備階段，甚至在患者接受治療后，隨著CAR-T細胞在體內(nèi)的持續(xù)擴增，依然存在產(chǎn)生RCL/RCR的潛在風(fēng)險。終產(chǎn)品中復(fù)制型病毒的存在有可能引起病人不良反應(yīng)，構(gòu)成臨床隱患和潛在危險，故對復(fù)制型病毒檢測是安全性檢測中非常重要的項目。

隨著病毒載體在CGT領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，相關(guān)法規(guī)和技術(shù)原則對監(jiān)測復(fù)制型病毒提出了建議。

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心(CDE)在2020年9月發(fā)布《基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見稿）》：采用復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制型病毒載體時，應(yīng)在生產(chǎn)工藝的適當階段檢測生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生的具有復(fù)制能力的病毒、親本病毒或野生型病毒進行檢測，并根據(jù)給藥劑量等確定殘留量的標準限度。常見的復(fù)制型病毒檢測方法包括指示細胞培養(yǎng)法、直接qPCR法等?？蓮?fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒（RCR）檢測：建議采用敏感的指示細胞培養(yǎng)法進行RCR檢測。RCR擴增細胞與待測樣本進行共培養(yǎng)以大程度擴增RCR，在一定傳代次數(shù)和時間的傳代培養(yǎng)后取適量上清接種RCR指示細胞培養(yǎng)，以觀察、計數(shù)細胞病變集落或者進行RCR標志物的檢測。

2022年5月，CDE發(fā)布的《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中提到RCR：

美國FDA 2020年發(fā)布的關(guān)于RCR/RCL檢測指南提出：對于RCR/RCL的檢測包含指示細胞培養(yǎng)法、ELISA法(p24蛋白測定)、PCR/Q-PCR法（通過psi-gag或VSV-G聚合酶鏈反應(yīng)）、PERT法（產(chǎn)物增強性逆轉(zhuǎn)錄檢測法）共4種檢測方法。

中美歐三國監(jiān)管機構(gòu)對于復(fù)制型病毒的控制階段和檢測要求基本相同，在產(chǎn)品生產(chǎn)的各個階段以及在接受基于病毒載體的基因治療的患者后續(xù)監(jiān)測中進行檢測。并且各監(jiān)管機構(gòu)推薦的復(fù)制型病毒的檢測方法均是指示細胞培養(yǎng)法，該方法是復(fù)制型病毒檢測的金標準。

但考慮到CAR-T細胞終產(chǎn)品一般需要新鮮輸注的特殊情況，基于細胞培養(yǎng)法的RCL/RCR檢測方法周期較長，建議在細胞產(chǎn)品制備過程中進行全面控制(如對慢病毒載體及生產(chǎn)終末細胞采用基于細胞培養(yǎng)方法測定RCL/RCR，以確保生產(chǎn)工藝過程中不存在RCL/RCR的風(fēng)險)，細胞終產(chǎn)品階段可采用qPCR快檢法快速放行。

針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒RCR檢測試劑盒，采用熒光探針RT-PCR法特異性擴增逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上包含env在內(nèi)的序列，專一快速的檢測各種使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相關(guān)的細胞產(chǎn)品中可能發(fā)生的復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒的潛在風(fēng)險。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器。