一、概述

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用，它并不是病理?xiàng)l件下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為了更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡。今天，小愛向大家介紹細(xì)胞凋亡六大常用方法：細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸檢測、TUNEL缺口末端標(biāo)記法、線粒體膜電位檢測、Caspase凋亡核心分子檢測、形態(tài)學(xué)觀察、線粒體膜電位轉(zhuǎn)換孔檢測。

細(xì)胞凋亡檢測方法大全

二、檢測方法

1、細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸檢測

基于細(xì)胞代謝物進(jìn)行的檢測方法有Annexin V-FITC/PI檢測法(abs50001)、Annexin V-EGFP/PI檢測法(abs50006)、Annexin V-APC/PI檢測法(abs50009)、Annexin V-PE/7-AAD檢測法(abs50007)、Annexin V-APC/7-AAD檢測法(abs50008)。今天，小愛給大家著重講一下Annexin V-FITC/PI檢測法。

（1）檢測原理

Annexin V/PI檢測原理

（2）適用樣本：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞

（3）設(shè)備：流式細(xì)胞儀/熒光顯微鏡

（4）優(yōu)勢：Annexin是目前最敏感的指標(biāo)之一；定性、定量

（5）Annexin V細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

在熒光顯微鏡下，以Annexin V-FITC＆PI雙染可以鑒別正常細(xì)胞、早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞。如上圖所示，a、b、c為熒光顯微鏡下的凋亡細(xì)胞，其中a、b分別為Annexin V-FITC和PI單染，c為Annexin V-FITC＆PI雙染；d為普通光學(xué)顯微鏡下的凋亡細(xì)胞（紅色箭頭所指為晚期凋亡細(xì)胞，綠色箭頭所指為早期凋亡細(xì)胞）。

Annexin V 細(xì)胞凋亡流式檢測結(jié)果

客戶使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(abs50001)的效果如上圖，文獻(xiàn)名稱：Serine metabolism antagonizes antiviral innate immunity by preventing ATP6V0d2-mediated YAP lysosomal degradation 期刊：Cell Metabolism影響因子： 27.287

（6）Annexin V細(xì)胞凋亡檢測注意事項(xiàng)

A、建議不用含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞；

B、建議在用胰蛋白酶處理前單獨(dú)收集培養(yǎng)液中懸浮的細(xì)胞，保存在2%的BSA中；

C、試劑使用前低速離心，以免液體積存管蓋和管壁；

D、Annexin V-FITC和PI是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光。在處理和標(biāo)記時，盡可能在暗處進(jìn)行。在孵育階段，用鋁箔包裹容器或置于抽屜中。細(xì)胞標(biāo)記后，在暗室內(nèi)用顯微鏡觀察；

E、整個操作過程動作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4℃下操作，以免影響細(xì)胞狀態(tài)；

F、在細(xì)胞洗滌的最后一步，請盡量將上清棄凈，以免PBS殘留，有可能會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

G、為防止熒光衰變，宜在1h內(nèi)進(jìn)行流式檢測；

H、PI 染色時間過長有可能造成檢測的凋亡率偏高，建議首先進(jìn)行Annexin V-FITC染色，最短可在上機(jī)前5min再加入PI染色。

（7）Annexin V試劑盒選擇指南

2、TUNEL缺口末端標(biāo)記法

基于TUNEL缺口進(jìn)行的檢測方法有TUNEL-Biotin檢測法(abs50022)、TUNEL-488檢測法(abs50047)、TUNEL-594檢測法(abs50058)。今天，小愛給大家著重講一下TUNEL-488檢測法。

（1）檢測原理

TUNEL缺口末端標(biāo)記法檢測原理

基因組DNA雙鏈或單鏈斷裂時會出現(xiàn)產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化作用下，與488/Cy-dUTP結(jié)合，從而通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀直接進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測。

（2）適用樣本：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、細(xì)胞涂片、石蠟切片、冰凍切片

（3）設(shè)備：流式細(xì)胞儀、光學(xué)/共聚焦/熒光顯微鏡，熒光酶標(biāo)儀等

（4）優(yōu)勢：操作簡單，定性準(zhǔn)確

（5）TUNEL細(xì)胞凋亡檢測FAQ

A、紅色熒光和綠色熒光的試劑盒與生物素標(biāo)記的試劑盒有何不同？

最大的區(qū)別在于適配的儀器不同，生物素標(biāo)記的試劑盒適配光學(xué)顯微鏡，所以在細(xì)胞核染色時生物素標(biāo)記的試劑盒一般適配蘇木素或者甲基綠，熒光素標(biāo)記的試劑盒一般適配DAPI ，但是熒光素標(biāo)記的試劑盒實(shí)驗(yàn)時間、短操作簡便、結(jié)果易觀察。

B、陽性對照和陰性對照的作用？

陽性組對照用來驗(yàn)證本次實(shí)驗(yàn)操作和試劑盒有無問題，陰性組對照為了排除細(xì)胞自身凋亡、操作過程、或者染料等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧?/strong>，也用于調(diào)整拍攝曝光強(qiáng)度。一般情況下只需一個陽性對照和一個陰性對照，多個組織也可以設(shè)立多個陰性對照。

C、非特異標(biāo)記（假陽性）？

a、細(xì)胞或組織的核酸酶或聚合酶活性水平較高（如平滑?。珼NA被切斷，易導(dǎo)致假陽性。建議：取出細(xì)胞或組織后要立即并充分固定，阻止這些酶的活性，設(shè)置陰性對照有助于判斷；

b、內(nèi)源性過氧化物酶影響，建議：對于肝臟、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織，適當(dāng)延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度；

c、固定液濃度過高或過低，導(dǎo)致組織中心部分固定效果不佳，而使得中心部細(xì)胞自溶、DNA鏈出現(xiàn)不規(guī)則斷裂，產(chǎn)生假陽性。建議：推薦使用4%多聚甲醛；

d、TdT酶反應(yīng)時間過長或Tunel反應(yīng)過程中反應(yīng)液發(fā)生蒸發(fā)或滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤。建議：注意控制反應(yīng)時間，并確保TdT酶反應(yīng)液能覆蓋樣品；

e、石蠟、脂肪、血液、體液等都較易與染料結(jié)合，所以組織切片制作時要保持干凈、脫蠟要che底；

f、有些試劑或細(xì)胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色。

D、沒有染上熒光？

a、固定不充分。固定液選4%多聚甲醛，現(xiàn)用現(xiàn)配。不建議使用乙醇，乙醇固定液對組織的滲透力較弱，影響TUNEL標(biāo)記效率；

b、細(xì)胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達(dá)核內(nèi)。細(xì)胞與冰凍切片，可用2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蠟切片推薦使用蛋白酶K，37℃通透30min；不同的細(xì)胞和組織所需要的通透時間略有不同，時間太長容易脫片，適當(dāng)調(diào)整；

c、延長標(biāo)記時間至2h，并適當(dāng)增加TdT酶及dUTP的用量；

d、確定實(shí)驗(yàn)對象細(xì)胞有凋亡。準(zhǔn)備一份DNase I處理的陽性對照，驗(yàn)證TdT酶反應(yīng)是否正確進(jìn)行。

E、熒光背景高？

a、支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗(yàn)證；

b、TdT酶反應(yīng)時間過長，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的TdT酶僅供當(dāng)日使用；

c、DAB孵育時間過長，減少DAB染色時間；

d、處于高速分裂和增殖狀態(tài)中的細(xì)胞，有時也會出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測；

e、有些試劑或細(xì)胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色；

f、Biotin-X-dUTP的非特異性結(jié)合，在TdT酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100和1mg/mL BSA的PBS洗三次。

F、標(biāo)記率低？

a、乙醇、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標(biāo)記效率較低（因?yàn)樵诠潭〞r染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失），采用推薦的固定液；

b、固定時間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高，減少固定時間；

c、貼壁細(xì)胞如果使用藥物誘導(dǎo)凋亡，會細(xì)胞皺縮，貼壁黏附力降低，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞容易脫落。建議：請注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細(xì)胞在洗滌時被洗去。后續(xù)整個操作也需要輕緩。

（6）TUNEL試劑盒選擇指南

TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒（綠色熒光）(abs50047)

3、Caspase凋亡核心分子檢測

基于Caspase凋亡核心分子進(jìn)行的檢測方法有Caspase 1活性檢測法(abs50023)、Caspase 2活性檢測法(abs50024)、Caspase 3/7活性檢測法(abs50025)、Caspase 4活性檢測法(abs50026)、Caspase 6活性檢測法(abs50027)。今天，小愛給大家著重講一下Caspase 3/7活性檢測法。

（1）檢測原理

Caspase-3活性檢測試劑盒的檢測原理圖

基于Caspase 3/7可以催化底物Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA (p-nitroaniline)，從而可以通過測定吸光度來檢測caspase 3/7的活性。pNA在405nm附近有強(qiáng)吸收。

（2）適用樣本：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、組織樣品

（3）設(shè)備：流式細(xì)胞儀、共聚焦/熒光顯微鏡，熒光酶標(biāo)儀等

（4）優(yōu)勢：靈敏度高，特異性強(qiáng)，與其他已知Caspases無交叉反應(yīng)

4、線粒體膜電位檢測

基于線粒體膜電位進(jìn)行的檢測方法有線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-10)(abs50017)、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(abs50016)。

（1）檢測原理

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-10)檢測原理圖

線粒體跨膜電位(Δψm)的下降，是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，利用染料追蹤測試線粒體膜電位。

（2）適用樣本：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、純化線粒體

（3）設(shè)備：流式細(xì)胞儀、共聚焦/熒光顯微鏡，熒光酶標(biāo)儀等

（4）JC-1細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

Fluorescence images of JC-1-stained chondrocytes

Flow cytometry results of JC-1-stained chondrocytes

客戶使用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(abs50016)的效果如上圖，文獻(xiàn)名稱：Curcumin exerts chondroprotective effects against osteoarthritis by promoting AMPK/PINK1/Parkin-mediated mitophagy 期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy  影響因子： 7.18

5、線粒體膜轉(zhuǎn)換孔檢測

基于線粒體膜轉(zhuǎn)換孔進(jìn)行的檢測方法有線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)檢測試劑盒(abs50064)。

（1）檢測原理

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)檢測原理圖

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時和病理性死亡時，線粒體膜電位轉(zhuǎn)換孔滲透性發(fā)生改變，Ca²⁺的過載，線粒體谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后繼細(xì)胞色素C的釋放，線粒體膜電位下降等都會導(dǎo)致線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的激活。

（2）適用樣本：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞

（3）設(shè)備：流式細(xì)胞儀、共聚焦/熒光顯微鏡，熒光酶標(biāo)儀等

（4）染料：Calcein AM

6、形態(tài)學(xué)觀察

基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)行的檢測方法有熒光顯微鏡/光學(xué)顯微鏡觀察法{DAPI染色法(abs47047616)、Hoechest 染色法(abs47047620)、AO染色法(abs9735)、HE染色法(abs9217)}、透射電子顯微鏡觀察法。

（1）熒光顯微鏡/光學(xué)顯微鏡觀察法

A、檢測原理

Emodin induces apoptosis of human cervical cancer hela cells via intrinsic mitochondrial and extrinsic death receptor pathway. Cancer cell international. 13. 71. 10.1186/1475-2867-13-71.

借助相應(yīng)的染色方法，直接觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。常用熒光染料有Hoechest 33342、吖啶橙(AO)、DAPI等；化學(xué)染料有蘇木精 -伊紅(HE)、姬姆薩(Giemsa)或賴特(Wright)

B、樣本類型：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、細(xì)胞涂片、石蠟切片、冰凍切片

C、優(yōu)勢：操作簡單，成本低

D、缺點(diǎn)：主觀性較大，定性和定量較差，極少單獨(dú)使用

（2）熒光顯微鏡/光學(xué)顯微鏡觀察法

A、檢測原理

Hydrostatic pressure can induce apoptosis of the skin. Scientific Reports. 10. 10.1038/s41598-020-74695-5.

細(xì)胞凋亡發(fā)生時會出現(xiàn)一定的形態(tài)學(xué)特征，電鏡下凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、核濃縮、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體出現(xiàn)等。

B、樣本類型：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、細(xì)胞涂片、石蠟切片、冰凍切片

C、優(yōu)勢：經(jīng)典、可靠，金標(biāo)準(zhǔn)

D、缺點(diǎn)：成本高、耗時長，步驟繁瑣，無法定量，判定時存在主觀性，一次只能觀察小片區(qū)域。

今天講解就到這了，大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問題，歡迎一起交流哦！

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