隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因植物在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以幫助科學(xué)家更好的理解植物或農(nóng)作物的生物學(xué)功能驗(yàn)證。然而，如何準(zhǔn)確、快速地檢測轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因表達(dá)和功能，一直是科學(xué)家們面臨的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測方法如PCR、Southern blot、Northern blot等，雖然具有一定的準(zhǔn)確性和可靠性，但也存在著操作復(fù)雜、耗時耗力、靈敏度低等缺點(diǎn)。因此，建立操作簡便、直接從目的蛋白表達(dá)量篩選高表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株一直是植物分子生物學(xué)家要解決的技術(shù)難題。

熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)作為一種新型的轉(zhuǎn)基因檢測方法，具有操作簡便、靈敏度高、實(shí)時監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，一直是轉(zhuǎn)基因研究中的重要手段。熒光素酶是一種能夠催化熒光素氧化并產(chǎn)生生物發(fā)光的酶。在轉(zhuǎn)基因植物中，將熒光素酶基因與目標(biāo)基因的啟動子或其他調(diào)控元件連接，構(gòu)建成報(bào)告基因載體。當(dāng)目標(biāo)基因表達(dá)時，熒光素酶也會隨之表達(dá)。通過加入熒光素底物，可以檢測到熒光素酶產(chǎn)生的生物發(fā)光信號，從而間接反映目標(biāo)基因的表達(dá)水平。

圖1：熒光素酶報(bào)告基因工作原理

近日，日本的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為Lumi-Map的高通量平臺，該平臺結(jié)合了基于孔板的熒光素酶 (LUC) 報(bào)告基因檢測和突變圖譜 (MutMap) 的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對突變體的高效篩選和基因功能的快速鑒定，為我們揭示了擬南芥中參與病原體相關(guān)分子模式 (PAMP) 觸發(fā)免疫的基因。這一研究成果不僅為植物免疫機(jī)制的研究提供了新的思路，也為熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用提供了成功的范例。

圖2：Lumi-Map方法的示意圖。用甲基磺酸乙酯 (EMS) 誘變WRKY29報(bào)告菌株（W29-1-4），獲得M2后代獲得的。通過flg22處理的M2幼苗的生物發(fā)光監(jiān)測進(jìn)行突變體篩選。PTI=病原體相關(guān)分子模式觸發(fā)免疫。將表現(xiàn)出突變型生物發(fā)光表型的M2幼苗繁殖到WRKY29表達(dá)改變的M3和突變體經(jīng)flg22處理（awf突變體），然后在確認(rèn)生物發(fā)光表型后選擇。病因基因鑒定由MutMap。將awf突變體與親本報(bào)告系（W29-1-4）雜交，自交F1后代獲得F2。F2株用flg22處理并對其生物發(fā)光表型進(jìn)行監(jiān)測。對F2突變株的DNA進(jìn)行全基因組測序通過MutMap分析來確定致病的單核苷酸多態(tài)性（snp）。

研究人員創(chuàng)建了9種轉(zhuǎn)基因擬南芥報(bào)告系，該報(bào)告系中包含由防御基因啟動子驅(qū)動的LUC基因。當(dāng)植物受到PAMP（如flg22）處理時，啟動子被激活，從而會產(chǎn)生生物發(fā)光。通過篩選24,000個經(jīng)甲基磺酸乙酯 (EMS) 誘導(dǎo)的突變體，研究人員鑒定了22個在flg22處理后WRKY29表達(dá)改變的突變體（簡稱awf突變體）。與PAMP觸發(fā)免疫相關(guān)的阿拉伯芥基因包括FLS2（鞭毛素感知受體），以及在研究中發(fā)現(xiàn)的其他三個未被之前關(guān)聯(lián)的基因。通過結(jié)合Lumi-Map和MutMap，研究者能夠快速識別出與PTI信號傳導(dǎo)相關(guān)的致病突變。

圖3：9個擬南芥報(bào)告系經(jīng)flg22處理后的生物發(fā)光信號，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株8天大的幼苗包含pWRKY29-LUC、pWRKY18-LUC、pWRKY28-LUC、pRBOHD-LUC、pPAL1-LUC、pPR4-LUC、pERF1-LUC、pAt1g51890-LUC、pAt2g17740-LUC用水（綠色）或0.5µM flg22（藍(lán)色）處理。實(shí)時監(jiān)測每棵幼苗的生物發(fā)光情況系統(tǒng)在時間點(diǎn)。數(shù)據(jù)以每次處理至少7株幼苗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

本研究中利用擬南芥的種子構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株，

其后的Lumi-Map高通量篩選的流程如下：

1種子處理：表面消毒后的種子在4°C黑暗環(huán)境孵育2天解除休眠；

2播種：處理后的種子播至96孔微孔板，每孔加150 µl 半濃度液體MS培養(yǎng)基（含0.5%蔗糖和50 µM D-熒光素-K）；

3光照和處理：連續(xù)光照培養(yǎng)7天促發(fā)芽，發(fā)芽幼苗用 0.5 µM flg22、0.5 µM elf18或1 mg/ml幾丁質(zhì)處理；

4密封：用板封密封96孔板保持濕度防蒸發(fā)；

5生物發(fā)光測量：用生物化學(xué)發(fā)光微孔板讀板儀進(jìn)行批量檢測；

6數(shù)據(jù)分析：用商業(yè)化軟件 (SL00-01) 分析生物發(fā)光數(shù)據(jù)評估不同處理影響。通過這些步驟可有效測量幼苗在不同處理下的生物發(fā)光反應(yīng)。

在上述案例中，Lumi-Map技術(shù)的創(chuàng)新之處在于將實(shí)時熒光素酶生物發(fā)光篩選與MutMap技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對突變體的高效篩選和基因功能的快速鑒定。

實(shí)時監(jiān)測：Lumi-Map技術(shù)可以實(shí)時監(jiān)測熒光素酶的生物發(fā)光信號，從而快速篩選出具有特定表型的突變體。這大大縮短了研究周期，提高了研究效率。

高通量篩選：該技術(shù)可以同時對大量的突變體進(jìn)行篩選，為大規(guī)?；蚬δ苎芯刻峁┝擞辛χС?。

基因定位：結(jié)合MutMap技術(shù)，可以快速確定與特定表型相關(guān)的基因位點(diǎn)，為進(jìn)一步的基因功能研究提供了重要線索。

得益于Lumi-Map技術(shù)平臺提供的高通量檢測效率，該研究團(tuán)隊(duì)在后續(xù)進(jìn)行了更多植物抗病的研究，并在Science雜質(zhì)上發(fā)表了研究論文，擬南芥中發(fā)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病菌的鞘脂的受體，揭示了植物識別病原體脂質(zhì)的機(jī)制。

此外，熒光素酶報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因植物中還有很多其他應(yīng)用：

1基因表達(dá)分析：通過監(jiān)測熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度，可以實(shí)時、定量地分析目標(biāo)基因在不同組織、發(fā)育階段或環(huán)境條件下的表達(dá)情況。例如，在研究植物對逆境脅迫的響應(yīng)時，可以利用熒光素酶報(bào)告基因觀察相關(guān)基因的表達(dá)變化。

2啟動子活性研究：將熒光素酶基因置于不同的啟動子下游，構(gòu)建成一系列報(bào)告基因載體，轉(zhuǎn)化植物后可以分析啟動子的活性。通過比較不同啟動子驅(qū)動下熒光素酶的表達(dá)水平，可以確定啟動子的強(qiáng)度、組織特異性和誘導(dǎo)性等特性。

3蛋白質(zhì)定位研究：通過將熒光素酶與目標(biāo)蛋白質(zhì)融合表達(dá)，可以利用熒光素酶的發(fā)光信號來確定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位。例如，研究人員可以將熒光素酶與細(xì)胞膜蛋白、細(xì)胞器蛋白或核蛋白等融合，觀察其在植物細(xì)胞中的分布情況。

4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究：熒光素酶報(bào)告基因可以用于研究植物中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。例如，在研究植物激素信號通路時，可以將熒光素酶基因與激素響應(yīng)元件連接，構(gòu)建成報(bào)告基因載體。當(dāng)植物受到激素刺激時，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，熒光素酶的表達(dá)也會隨之改變。通過監(jiān)測熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度，可以實(shí)時跟蹤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程，揭示信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制。

熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)作為一種新型的轉(zhuǎn)基因檢測方法，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測方法相比，熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢，

在轉(zhuǎn)基因植物的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景：

1操作簡便性：傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測方法，如 PCR、Southern blot、Northern blot 等，需要進(jìn)行復(fù)雜的核酸提取、電泳、雜交等操作流程，既耗時又費(fèi)力。而熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)僅僅需要將報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)化到植物中，然后加入熒光素底物即可檢測生物發(fā)光信號，操作簡便快捷

2靈敏度：熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)具有靈敏度，能夠檢測到極低水平的基因表達(dá)。

3實(shí)時監(jiān)測：熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)可以對基因的表達(dá)變化進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，而傳統(tǒng)方法只能檢測某一特定時間點(diǎn)的基因表達(dá)情況。

4空間分辨率：通過將熒光素酶與目標(biāo)蛋白質(zhì)融合表達(dá)，可以利用熒光素酶的發(fā)光信號來確定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位，具有較高的空間分辨率。而傳統(tǒng)方法無法提供蛋白質(zhì)的定位信息。

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吸光度

熒光強(qiáng)度

熒光偏振

氙燈時間分辨熒光

激光時間分辨率熒光

Alpha，0.1nm光譜掃描等模式