NGS方法已被廣泛用于檢測大多數(shù)序列變異。然而，這些方法無法準確解析基因組中復雜的重復或高GC含量區(qū)域。這使得結(jié)構(gòu)變異的檢測尤其具有挑戰(zhàn)性。利用Bionano 光學基因組圖譜技術 (Optical genome mapping,OGM)，可以在高靈敏度下以無偏、全基因組的方式檢測結(jié)構(gòu)變體。這項革命性的技術揭示了傳統(tǒng)測序和細胞遺傳學分析之前的“盲點”；然而，它需要分離超高分子量（UHMW）DNA。超長分子的長度通常在250 kbp以上甚至超過1 Mbp，傳統(tǒng)的提取方法很難完整獲取。為了應對這一技術挑戰(zhàn)，Hamilton與Bionano Genomics合作開發(fā)了提供超高分子量DNA提取的自動化解決方案-Long String VANTAGE. 這使得基因組DNA提取過程中大大減少了碎片的產(chǎn)生。從這一自動化過程中提取的超高分子量DNA進而被標記，并為光學基因組作圖（OGM）分析生成高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

在不斷發(fā)展的基因組研究領域，技術創(chuàng)新為深入了解以前尚未解決的基因組生物學問題提供了機會。超長DNA分子的繪圖改變了我們看待基因組的方式，對其結(jié)構(gòu)的分辨率達到了很高的水平。Hamilton提供超高分子量DNA提取的自動化解決方案-Long String Vantage. 利用這種高效、省時的樣本處理解決方案，可以更高通量的實現(xiàn)光學基因組作圖（OGM）。

方法描述

?該方法基于 Bionano Prep SP 冷凍細胞沉淀 DNA 提取方法，并對自動化過程進行了優(yōu)化。簡言之，將約100萬個細胞的冷凍 HL-60 細胞沉淀手動重懸于含有 RNase A 的 DNA 穩(wěn)定緩沖液中，并放置在96深孔板中。后續(xù)步驟將在Long String VANTAGE 儀器上自動化執(zhí)行。

細胞裂解和蛋白酶 K消化將在特制緩沖液中進行。隨后通過加入 PMSF 終止該過程。通過加入異丙醇將 UHMW DNA 結(jié)合到 Bionano Prep SP Disk上。隨后進行3個洗滌步驟，從結(jié)合的DNA中去除雜質(zhì)。對于最終洗脫，將Disk轉(zhuǎn)移至微孔板頂部的預填充洗脫緩沖液條中。

最后，用戶可以在臺面外進行離心步驟，將最終洗脫液留在微孔板中，將Disk保留在 Hamilton 洗脫條中。該過程獲得了適用于 Bionano Genomics 下游直接標記和染色 (DLS) 過程的 UHMW DNA 提取物。該過程基于酶法進行基因組特異性標記，最終可在Bionano Genomics Saphyr ®系統(tǒng)上收集數(shù)據(jù)。

系統(tǒng)描述

Long String VANTAGE 是一種即用型工作站，具有標準化硬件配置，適用于自動化magnetic disk或磁珠處理工作流程。本品僅適用于研究用途 (RUO)。其基于Microlab ®VANTAGE平臺，具有4個1 mL CO-RE ®移液通道以及4個用于disk處理步驟的5 mL CO-RE®通道。

應用軟件

Long String VANTAGE VENUS框架是專門為該方法而設計和開發(fā)的。

試劑盒描述

Bionano 的 SP 血液和細胞培養(yǎng) DNA 分離試劑盒 (80042) 是在Long String VANTAGE 上開發(fā)UHMW DNA 提取自動化工作流程的基礎。該方法通過簡單的裂解、結(jié)合、洗滌和洗脫流程來獲得UHMW DNA。該試劑盒使用的是由納米結(jié)構(gòu)二氧化硅表面覆蓋的順磁盤，而不是磁珠或硅基離心柱。這提供了高 DNA 結(jié)合能力，并有助于保護結(jié)合的 DNA 免受剪切力破壞?；厥盏?UHMW DNA 大小通常在 250 kbp 至 > 1 Mbp之間，濃度范圍為50-120 ng/µL。

可視化流程

使用人白血病細胞系HL-60細胞沉淀測試自動化方案。

HL-60細胞（DMSZ，ACC3）在DMEM+10%FBS和雙抗培養(yǎng)基中于37°C，含5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。通過離心收集細胞，并在使用前作為1.5 M HL-6細胞的細胞沉淀在-80°C下冷凍存儲。在實驗當天，將細胞沉淀在37°C下解凍30秒，并通過手動移液將其重懸于40μL DSB/RNase Cocktail混合液中。將得到的細胞懸浮液合并，將對應于100萬個細胞的體積轉(zhuǎn)移到96深孔板的單個孔中，并提供給Long String VANTAGE。在對層疊在洗脫板頂部的條帶進行裂解和消化、結(jié)合、洗滌和Disk轉(zhuǎn)移后，在室溫下以2200 rcf對洗脫板組件進行離心1分鐘。

該方法成功的得到驗證，每次可處理12個樣品。使用相同參數(shù)共進行了4次驗證試驗（3次試驗，4個樣品，1次試驗，12個樣品）。

在Long String VANTAGE上洗脫UHMW DNA后，使用標準200μL吸頭將樣品剪切4次，然后在Hula混合器上進行1小時顛倒混勻，并在室溫下孵育過夜。根據(jù)說明書，使用Qubit dsDNA BR檢測試劑盒對UHMW DNA進行定量。然后使用Bionano Prep直接標記和染色（DLS）方案的優(yōu)化版本標記DNA。根據(jù)系統(tǒng)用戶指南，使用Qubit 1X dsDNA HS檢測試劑盒對標記的DNA進行定量，并將其加載到Bionano芯片上，在Saphyr儀器上運行。收集所有樣品大于150kbp分子的400Gbp光學數(shù)據(jù)。

技術

Hamilton專有的磁棒技術確保了最佳的Magnetic Disk處理。Paramagnetic Disk可通過5ml移液通道直接操作，無需額外的臺面設備?？烧{(diào)參數(shù)設置確保最佳實驗結(jié)果。

Hamilton Magrod套筒以最高的精度制造，并根據(jù)可能的最佳Magnetic Disk定位進行塑形。匹配可保護Magrod免受周圍液體和試劑的影響。Hamilton洗脫條用于通過離心從最終UHMW DNA樣品中分離Magnetic Disk。Disk保留在條帶中，而洗脫液被吸入微量滴定板。

結(jié)果

自動化過程獲得的結(jié)果表明，樣品產(chǎn)率是可重復的，并符合Bionano Prep SP冷凍細胞沉淀DNA分離方案（圖A，藍條）中規(guī)定的手動提取的預期值。

DLS標記后進行額外的樣品濃度測量，以確保有足夠的產(chǎn)量用于進一步處理（圖A，灰點）。數(shù)據(jù)表明，對于在Long String VANTAGE上分離的所有樣品，都回收和體現(xiàn)了合適量的產(chǎn)物DNA。

在Saphyr儀器上運行的樣本數(shù)據(jù)分析表明，分子長度超過了Bionano Genomics提供的閾值，并證明存在大于230 kbp的超高分子量DNA（圖B）。從Hamilton Long String VANTAGE分離的DNA包含Mbp長度的分子，在提取、標記、線性化和成像后，其總體上超過了230 kbp的OGM質(zhì)量閾值。

從Saphyr儀器收集的數(shù)據(jù)中得出了進一步的質(zhì)量控制指標（下圖）。所有樣本在特異性和靈敏度范圍內(nèi)均顯示出一致的標記性能（下圖A、B）。Map率超過了Bionano Genomics提供的質(zhì)量指標閾值（下圖C）。

Long String VANTAGE可在一個工作日（8小時）內(nèi)處理多達12個樣品。這比手動方法的效率顯著增加，建議每次運行6個樣本。

結(jié)論

作為精密自動化液體處理的專家和對基因組工作流程的關注，Hamilton正在進入這個應用領域。我們與Bionano Genomics合作，建立了超高分子量DNA提取自動化解決方案。結(jié)合光學基因組作圖，Long String VANTAGE將能夠以從樣本中標準化且可重復地提取超高分子量DNA，賦能您的基因研究。