文庫產出低，該不該上機？

①樣本丟失：細胞離心后在EP管中幾乎不可見，棄去上清液時容易造成丟失。建議在細胞離心過程中，將EP管統(tǒng)一方向并標記細胞沉積位置，在沉淀對立面輕輕棄去上清，實驗操作過程中避免劇烈渦旋振蕩。

②不需要很糾結文庫產出，能夠達到上機標準的產出，且文庫峰型符合ATAC文庫峰型，便可以上機測序。增加擴增循環(huán)數(shù)，反而會導致dup 偏高。

ATAC文庫在進行質檢時，文庫呈現(xiàn)什么樣的分布是正常的分布？

轉座酶會容易與核小體間隔部分的DNA接觸，發(fā)生打斷反應。構建成功的ATAC文庫在2100峰圖上會呈現(xiàn)明顯的核小體的pattern特征峰，其中：

第一個在180-200bp的位置，屬于核小體之間的區(qū)域（40＋136）bp

第二個在300-400 bp

第三個在500bp左右

如果有第四個會在700bp附近

核小體全長一般在180～200 bp，平均200 bp。其中，140多bp是直接盤繞在組蛋白八聚體核心外面，這些DNA不易被核酸酶消化；其余為核小體間區(qū)。不同組織、細胞，同一細胞染色體的不同區(qū)段，盤繞在組蛋白八聚體核心外面的DNA長度是不同的，如：真菌的可短至154bp、海膽精子的可長達260bp。

培養(yǎng)細胞進行ATAC-seq時支原體污染嚴重，使用支原體清除劑后，細胞是否能夠繼續(xù)進行建庫？

支原體是原核生物，DNA呈裸露狀態(tài)，當細胞被支原體感染，進行ATAC-seq實驗時，裸露的DNA會被切割，擴增。使用支原體清除劑清除后，仍會有DNA殘留，進行ATAC-seq實驗捕獲的開放區(qū)域占比少。存在污染時，污染會被放大。

Mapping 率低的原因與排查方案？

細胞培養(yǎng)或取樣過程中，有時會出現(xiàn)樣本被外源微生物污染的情況。ATAC建庫基于Tn5轉座酶切斷開放DNA，而微生物基因組暴露程度高，相較真核宿主基因組更易發(fā)生轉座反應。即使少量微生物污染，在所得文庫中也會占據(jù)較大比例。

可以從以下方面進行排查：①確認細胞培養(yǎng)或實驗過程中有無污染；②確認參考基因組是否選擇正確；③分析unmapping數(shù)據(jù)比對的物種類型。

Dup Rate 值偏高分析

Dup Rate一般與建庫中的PCR循環(huán)數(shù)相關。

①PCR擴增帶有一定的偏好性和錯配率，會影響最終形成文庫的覆蓋度和測序準確性；

②PCR本身對于不同GC含量的樣本的擴增效率是不同的，PCR循環(huán)越多，擴增困難和擴增容易的片段之間相差就會越大，對應的分子多樣性就會越低，dup就會增大；

③PCR本身在擴增的過程中可能會產生一些堿基的錯配，錯誤的擴增可能會到出現(xiàn)與現(xiàn)有相同基因的結果，導致dup值升高。因此無需為獲得更高的文庫產量而設置過高的擴增循環(huán)數(shù)。

轉錄起始位點（TSS）附近的信號分布

轉錄活躍的基因的TSS往往處于開放狀態(tài)，以保證轉錄因子可以結合。所以，NFR fragments（開放染色質中兩個核小體之間的LinkerDNA片段）應該富集在轉錄起始位點（TSS）附近（圖中黑色實線），而結合核小體的區(qū)域在TSS位置應該缺失且在TSS兩側相對富集（圖中紅色虛線）。

ATAC-seq 文庫是否可以兼容華大平臺測序？怎么做？

ATAC文庫可以兼容 Illumina和 MGI測序，且已驗證所分析的下機數(shù)據(jù)結果一致。

上機測序方案：ATAC文庫構建后，使用轉化試劑轉化為華大文庫，隨后進行環(huán)化上機。

測序策略：推薦使用PE150。PE150為雙端測序，SE50為單端測序，由PE150測序所獲得的有效片段信息較SE50更多，因此獲得的數(shù)據(jù)更優(yōu)。

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