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胎牛血清培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞常用的方法有貼塊法(explant)和酶解離法(enzyme disperse)。下面一起來看下這兩種方法。
1.貼塊法
方法：動(dòng)物經(jīng)頸動(dòng)脈放血后，在無菌操作下迅速取出胸腹主動(dòng)脈段，置于含Hank's液的平皿中漂洗3次，將凝塊洗干凈后剝除外膜的纖維脂肪層，然后縱行切開血管，刮除內(nèi)膜即內(nèi)皮細(xì)胞迅速撕下中膜內(nèi)、中層，切成約1mm寬的小條，浸泡在含血清的Hank's液中，并將撕下小組織塊種植于培養(yǎng)瓶壁。置于37℃恒溫箱，2h左右，取出培養(yǎng)瓶加入20% HyClone胎牛血清的培養(yǎng)液，再放回培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)4天。4天后可見細(xì)胞從組織中遷移游出。
不同動(dòng)物血管結(jié)構(gòu)有差異，豬和猴較易操作，但小動(dòng)物如兔、鼠因其血管小，血管壁薄等特點(diǎn)，使之難以分離。另外組織塊太薄，不易粘附培養(yǎng)基，也使細(xì)胞較難生長。為了保證培養(yǎng)的成功，應(yīng)注意：
①種植組織塊的數(shù)目，如75cm2的長頸瓶組織塊不得少于30;
②根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的種屬加入適量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，應(yīng)加胎牛血清(FBS)，通常濃度為10%～20%;
③培養(yǎng)基的選擇：常用的有DMEM(Dulbecco's modified Eagles'medium)，M199培養(yǎng)基。培養(yǎng)兔的平滑肌細(xì)胞用DMEM效果較好。
2.酶解離法
沿動(dòng)脈縱軸切開后，刮除內(nèi)皮細(xì)胞撕下中膜的內(nèi)2/3，注意不要混入內(nèi)皮細(xì)胞，將組織塊切成1-2mm2，放入加有3mg/ml膠原酶的無血清M199培養(yǎng)基中，37℃，0.5～1.5h。離心去上清，重復(fù)上述消化步驟，然后再離心(9000r,4min)，收集細(xì)胞，在5%～10%同種血清或HyClone胎牛血清的M199培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞數(shù)，然后轉(zhuǎn)入30～90mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，對于兔子應(yīng)加入高濃度的谷氨酰胺(0.2g/L)較佳。不同研究者在培養(yǎng)基、酶濃度以及消化時(shí)間等的選擇都有很大的差異。
3.總結(jié)：貼塊法具有獲得平滑肌細(xì)胞純度高，量多，操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。但用貼塊法易使平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)肌絲喪失，亞細(xì)胞器增加。相反，酶解離法，由于酶的作用使細(xì)胞間失去連接，細(xì)胞內(nèi)肌絲含量豐富，保持收縮型狀態(tài)。培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞常取材于兔、豬、鼠、猴的胸腹主動(dòng)脈段。由于貼塊法和解離法處理方式不同，在細(xì)胞培養(yǎng)的zui初階段細(xì)胞形態(tài)和性質(zhì)存在差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)環(huán)境趨于一致，細(xì)胞特性上也趨于近似。
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