細(xì)胞凋亡過程常伴隨著明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，比如細(xì)胞凋亡早期，質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸會翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)膜表面；而在凋亡的中后期，隨著細(xì)胞質(zhì)膜通透性的增大，一些較大分子的化合物，如碘化丙啶(PI)，便可自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞核染上紅色熒光。

Annexin VPI檢測法原理

Annexin V是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。它不能透過完整的細(xì)胞膜，而早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完好的，對PI有拒染性。但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染上。因此Annexin V 和PI同時使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞與其它細(xì)胞區(qū)別開來。

Annexin VPI凋亡檢測推薦（李記生物）

[名稱]  流式凋亡檢測試劑盒

[貨號]  AC12L033

[規(guī)格]  100T

Annexin VPI檢測法操作步驟

? 對照管的設(shè)置

   1、空白管：誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞不加染料，用來調(diào)節(jié)電壓；

   2、單染管：分別需要只加PI和熒光標(biāo)記的Annexin V兩個單染管，用來調(diào)節(jié)補(bǔ)償；

   3、實驗管：誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加本次實驗的所有熒光染料；

   4、陰性管：正常培養(yǎng)細(xì)胞加入染料，確認(rèn)細(xì)胞正常狀態(tài)，排除假陽性。

? 懸浮細(xì)胞收集染色

   1、在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。

   2、取1~5×10^5重懸的細(xì)胞，離心5分鐘，棄上清，加入500µl 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。

   3、加入5µl Annexin V-FITC，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。

   4、室溫避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。

   5、隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

? 貼壁細(xì)胞收集染色

   1、把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，用胰酶細(xì)胞消化液(最好不用含有EDTA)消化細(xì)胞。

   2、細(xì)胞消化下來后，同理懸浮細(xì)胞的操作步驟。

? 上機(jī)檢測

      染色孵育后，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測或熒光顯微鏡檢測。

Annexin VPI流式結(jié)果圖（僅做參考）

圖：流式細(xì)胞儀凋亡檢測結(jié)果圖

 ? 左上象限(Annexin V-/PI+)：為細(xì)胞碎片、機(jī)械損傷細(xì)胞或其它死細(xì)胞；Annexin V-/PI+象限中細(xì)胞數(shù)越多，實驗結(jié)果可信度就越低，因盡量控制本象限細(xì)胞比例。

 ? 左下象限(Annexin V-/PI-)：為正常的活細(xì)胞；

 ? 右上象限(Annexin V+/PI+)：為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光；

 ? 右下象限(Annexin V+/PI-)：為早期凋亡細(xì)胞，在細(xì)胞凋亡的早期PI無法著染，不會產(chǎn)生紅色熒光信號。

Annexin VPI檢測法注意事項

 • 檢測貼壁細(xì)胞時，若不好控制消化時間，建議用Accutase細(xì)胞消化液，對細(xì)胞損傷小且不會改變細(xì)胞膜上PS的分布。

 • 選擇Annexin-V的熒光染料時要考慮細(xì)胞的自發(fā)熒光，特別是培養(yǎng)時間久或藥物處理的細(xì)胞，一定注意細(xì)胞代謝物藥物本身的熒光，一般來說細(xì)胞代謝物的自發(fā)熒光會干擾FITC/PE，所以可建議用Annexin-V APC，藥物的干擾可查看藥物本身的發(fā)射光譜是否會對檢測選擇的染料有影響。

 • 細(xì)胞染色完成后，禁止固定，盡快檢測完，可將檢測管放冰上，可減少外界環(huán)境對檢測結(jié)果的影響。

 • 在做凋亡統(tǒng)計時一般指統(tǒng)計前凋亡，因為只有前凋亡才有意義，當(dāng)然也有文獻(xiàn)統(tǒng)計總的凋亡比例（前凋亡和晚期凋亡之和），單純的統(tǒng)計晚期凋亡比例意義不大。