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近紅外激光器與SilVIR探測(cè)器助力高級(jí)多色熒光共聚焦成像

來(lái)源:儀景通光學(xué)科技(上海)有限公司   2025年02月13日 10:15  

激光掃描共聚焦顯微鏡是流行的生物研究工具。它們通常用于同時(shí)對(duì)多個(gè)熒光團(tuán)進(jìn)行成像,具有良好的色彩分離效果,還能通過(guò)增強(qiáng)的層切功能對(duì)生物標(biāo)本內(nèi)部進(jìn)行深層成像。


如今,炙手可熱的激光技術(shù)創(chuàng)新可使此類(lèi)應(yīng)用受益,并實(shí)現(xiàn)高級(jí)別的實(shí)驗(yàn)。在這篇文章中,我們將討論Evident的FV4000激光掃描共聚焦顯微鏡上的新型近紅外(NIR)方案如何為高級(jí)多色熒光成像提供動(dòng)力。


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在共聚焦顯微鏡檢查中同步采集5個(gè)以上通道

利用FV4000系統(tǒng)克服技術(shù)挑戰(zhàn)

讓我們先來(lái)了解一下多色成像實(shí)驗(yàn)的歷史。多年來(lái),許多研究人員都使用DAPI和其他兩種顏色(通常是綠色和紅色光譜)進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。
隨著抗體和成像系統(tǒng)的發(fā)展,有了更多的探測(cè)器和更出色的發(fā)射波長(zhǎng)濾色鏡,四色免疫熒光開(kāi)始流行。最常見(jiàn)的四色組合是將DAPI、綠色、紅色和近紅外色組合在一張圖像中。
但有兩個(gè)關(guān)鍵因素阻礙了第五或第六個(gè)通道的引入:


1.缺乏光束質(zhì)量好的近紅外激光二極管

首先,適合共聚焦顯微鏡的光束質(zhì)量好的近紅外激光二極管并不容易獲得。足夠的功率(但不能過(guò)高)、極低的功率波動(dòng)和兼容的光束輪廓都是用于共聚焦成像的激光二極管的必要特征。但直到最近,在這些波長(zhǎng)范圍內(nèi)也只有少數(shù)近紅外激光二極管可供選擇。

但由于全新激光二極管技術(shù)的出現(xiàn),改變了這一局面。我們的FV4000共聚焦顯微鏡現(xiàn)在提供685nm、730nm和785nm激光二極管,用于高效激發(fā)諸如下表所示的二級(jí)染料。


激光

熒光染料

λ_Ex (nm)

λ_Em (nm)

LD685

Alexa Fluor 680

679

702

DyLight 680

692

712

Alexa Fluor 700

696

719

iRFP720

702

720

LD730

ATTO 740

743

763

DiR

750

782

Alexa Fluor 750

752

779

Cy7

753

775

DyLight 755

754

776

LD785

DyLight 800

777

794

IR Dye 800CW

778

794

Alexa Fluor 790

782

805

Cy7.5

790

810


以上染料以及越來(lái)越多的新型熒光團(tuán)使得增加第五和第六個(gè)同步通道進(jìn)行多色成像變得更具吸引力。


2.近紅外波長(zhǎng)靈敏度降低的光電倍增管

實(shí)現(xiàn)高效近紅外成像的第二個(gè)挑戰(zhàn)是,許多被用作激光掃描共聚焦顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)探測(cè)器的光電倍增管(PMT)在近紅外波長(zhǎng)區(qū)域(750nm以上)的典型檢測(cè)波長(zhǎng)下靈敏度下降。

這種近紅外探測(cè)范圍內(nèi)靈敏度降低的情況,對(duì)于在可見(jiàn)光譜中部具有較高靈敏度的GaAsP PMT來(lái)說(shuō)尤其如此。在750nm以上范圍內(nèi),GaAsP探測(cè)器的靈敏度非常低。

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為了克服這一挑戰(zhàn),我們?cè)贔V4000激光共聚焦顯微鏡中采用了SilVIR探測(cè)技術(shù)。我們的SilVIR探測(cè)器利用硅光電倍增管(SiPM),這是一種半導(dǎo)體傳感器,可在400nm到900nm的寬波長(zhǎng)范圍內(nèi)采集高信噪比的熒光圖像。

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利用近紅外標(biāo)記,實(shí)現(xiàn)5~6色熒光同步光譜成像

得益于這項(xiàng)技術(shù),我們的FV4000系統(tǒng)可提供多達(dá)6個(gè)通道的SilVIR探測(cè)器,用于多色熒光應(yīng)用。

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與我們的X Line高性能物鏡配套使用,F(xiàn)LUOVEW FV4000系統(tǒng)可在400-1000nm范圍內(nèi)提供高質(zhì)量的寬色差校正。SilVIR探測(cè)器和X-Line物鏡的結(jié)合使多色熒光成像和整體近紅外成像的可靠性大大提高。

同時(shí),近紅外成像的效率受到光路系統(tǒng)多方面的影響,物鏡的紅外透過(guò)率和檢測(cè)器的檢測(cè)效率毋庸置疑是核心因素,但對(duì)于激光掃描共聚焦系統(tǒng),掃描單元的掃描振鏡涉及多次光路的傳輸,紅外的反射效率對(duì)圖像亮度的影響是指數(shù)級(jí)的,Evident共聚焦系統(tǒng)采用具有銀鍍膜的掃描振鏡,對(duì)比傳統(tǒng)鋁鍍膜,反射效率更高,在紅外波段的反射效率差異尤其明顯,這大大降低了紅外光信號(hào)的損失,保證了最終紅外信號(hào)的高靈敏探測(cè)。

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秉承百年科學(xué)探索精神,Evident不斷為生命科學(xué)研究提供創(chuàng)新工具和解決方案,助力探索生命奧秘。想要進(jìn)一步了解FV4000激光共聚焦顯微鏡如何助力您的科學(xué)研究,歡迎隨時(shí)聯(lián)系Evident申請(qǐng)演示.


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