1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

試劑準(zhǔn)備

40% Percoll溶液配制：

Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖液(10×)按體積比9:1混合，配制等滲100% Percoll母液。用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按體積比4:6混合，配制40%等滲Percoll溶液。

80% Percoll溶液：

Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖液(10×)按體積比9:1混合，配制等滲100% Percoll母液。用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按體積比8:2混合，配制80%等滲Percoll溶液。

2、腸道固有層免疫細(xì)胞分離步驟操作步驟

1）頸椎脫臼法處死小鼠并固定在手術(shù)臺上，75%酒精消毒小鼠腹部，于正中縱行剪開暴露腹腔；

2）如下圖所示，在小鼠胃與十二指腸連接處剪斷，一邊分離小腸周圍脂肪組織和腸系膜，一邊拉出小腸，之后在小腸和盲腸連接處剪斷，從而分離出小腸。

小鼠腸道組織解剖圖

3）10cm培養(yǎng)皿中加入5mL 4°C預(yù)冷的PBS，將步驟2中的小腸放入培養(yǎng)皿潤洗，使用鑷子和剪刀依次去除脂肪組織和派伊爾結(jié)。

小鼠派伊爾結(jié)去除操作圖

A. 去除表面脂肪和腸系膜等組織的小腸，紅色箭頭指示派氏結(jié)（平均每只小鼠有6-9個派氏結(jié)）；

B. 剪去派氏結(jié)的操作示意圖；

C. 去除派氏結(jié)后的小腸，紅框是所有剪下來的所有派氏結(jié)。

小鼠派伊爾結(jié)(Peyer's patches, PPs)是小鼠腸道黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要分布在小鼠小腸的下部，即遠(yuǎn)端空腸和回腸，與小鼠固有層免疫細(xì)胞的組成和功能有顯著差異，在分離小鼠腸道免疫細(xì)胞時，去除派伊爾結(jié)是為了確保獲得更純凈、更具代表性的目標(biāo)細(xì)胞群體，從而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

4）將小腸切成4段，用剪刀縱向剪開小腸（不必沿著腸系膜方向），暴露出腸內(nèi)容物，輕輕地將腸內(nèi)容物從粘膜表面刮除；

5）將小腸轉(zhuǎn)移到含有10mL HBSS + 2%FBS的50mL離心管中，劇烈渦旋10-20s；

6）用鑷子取出小腸重復(fù)清洗2次；

7）將清洗過的腸組織，剪碎成0.5cm的小片段，將組織塊(100-200mg)轉(zhuǎn)移到2mL圓底管中，加入1mL小鼠腸道組織解離液(abs50093)，37°C水平搖床輕輕搖晃孵育60min（根據(jù)組織糜爛狀態(tài)適當(dāng)延長孵育時間）；

8）從水平搖床中取出圓底管，劇烈渦旋10-20s，通過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)(abs7232)過濾，用10mL PBS沖洗細(xì)胞篩網(wǎng)；

9）收集含有細(xì)胞的濾液到50mL管中，20°C下400g離心5min，棄上清液，用 4 mL 40% percoll（abs9102）重懸細(xì)胞沉淀并轉(zhuǎn)移到 15 mL 離心管；

10）吸取 2.5 mL 80% percoll 深入到 15 mL 離心管底部，試管稍微傾斜，將 4 mL 40% percoll 與細(xì)胞的混合液沿著管壁緩慢加入離心管，覆蓋在 80% percoll 溶液的頂部形成密度梯度；

▲ 注意：不要破壞 80% percoll 和 40% percoll 與細(xì)胞的懸浮液的分界面，40% 和 80% percoll 現(xiàn)配現(xiàn)用。

11）800 g 20 °C 離心 20 min，升速（ACC）1，降速（DEC）1；

Percoll 分離組織免疫細(xì)胞示意圖

注：分離圖片參考自文獻(xiàn) DOI: 10.21769/BioProtoc.1010327

12）離心結(jié)束后，吸取中間白膜層免疫細(xì)胞至新的 15 mL 離心管中，加入 3 倍體積 4°C 預(yù)冷 PBS，上下顛倒混勻，4 °C 下 400 g 離心 5 min，棄上清；

13）按照步驟 12 重復(fù)清洗一次，棄上清得到腸道固有層淋巴細(xì)胞；

14）細(xì)胞染色緩沖液（abs9475）重懸細(xì)胞沉淀，并調(diào)整細(xì)胞濃度至 5-10×10⁶ cells/mL，將 100 μL/管的細(xì)胞懸液分配到 12×75 mm 的流式管（abs7303）中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

3、流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

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