輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，NADP+和NADPH 含量測定可以計算 NADP（NADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP+比值不僅是細胞氧化還原態(tài)的主要標志之一，而且在 PPP 途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

測定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NADP+和NADPH。NADPH 通過PMS 的遞氫作用，使氧化型噻唑藍（MTT）還原為甲瓚，570nm 下檢測吸光值，從而測定NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原NADP+為NADPH，從而檢測NADP+含量。

組成：

試劑二：粉劑×1 支，-20 ℃保存，用時加入 3ml 蒸餾水，混勻；溶解后 4 ℃保存一周；試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存，用時加入 3ml 蒸餾水，混勻；溶解后 4℃保存一周；試劑四：粉劑×1 支，4 ℃保存，用時加入 3ml 蒸餾水，混勻；溶解后 4℃保存一周；

自備儀器和用品：

酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

NADP+和 NADPH 的提取：

1、 血清（漿）中 NADP⁺和NADPH 的提取

NADP⁺的提取：按照血清（漿）體積（ml）：酸性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1ml

血清（漿），加入 1ml 酸性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADPH 的提取：按照血清（漿）體積（ml）：堿性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1ml

血清（漿），加入 1ml 堿性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織中NADP⁺和NADPH 的提取：

NADP⁺的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g 組織，加

入 1ml 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADPH 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g 組織，

加入 1ml 堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、 細胞或細菌中 NADP⁺和NADPH 的提取：

NADP⁺的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：酸性提取液體

積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADPH 的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：堿性提取液體

積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表(在 1.5ml 棕色EP 管中按下表依次加樣）：

充分混勻，靜置 5min 后，20000g，25℃離心 5min，棄上清，沉淀中加入：

混勻，取 200μl 轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96 孔板中，570nm 下讀取對照吸光值 A1 和測定管吸光值

A2，計算△A=A2-A1。

注意事項

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若NADP+測定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH 測定中△A（A2-A1）≤0.0259，說明樣本中輔酶含量較低，已低于檢測限，可做如下調(diào)整：（1）將測定管避光靜置時間 20min 延長到 60min；（2）在提取階段增加取樣量，即取 0.2g 樣本或 0.2ml 樣本加入 1ml 提取液。

5、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管，本試劑盒 100 管保證測 48 個NADP⁺或NADPH.

NADP+和 NADPH 含量的計算：

（一）NADP⁺含量的計算

標準條件下的回歸曲線為y = 0.0985x + 0.0144，R² = 0.9998；其中y 為△A，x 為NADP⁺濃度nmol/ml 1、血清（漿）中 NADP⁺含量計算

NADP⁺含量(nmol/ml）=[ (△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144）

2、組織、細菌或細胞中NADP⁺含量計算 (1)按樣本蛋白濃度計算

NADP⁺ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144）÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算

NADP⁺ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144）÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算

NADP⁺ (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144）

（二）NADPH 含量的計算

標準條件下的回歸曲線為y = 0.6198x + 0.0259，R² = 0.9977；其中y 為△A，x 為NADPH 濃度nmol/ml 1、血清（漿）中 NADPH 含量計算

NADPH 含量(nmol/ml）= [(△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A -0.0259）

2、組織、細菌或細胞中NADPH 含量計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259）÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算

NADPH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259）÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算

NADPH (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A -0.0259）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02ml；V2：加入提取液體積，2ml；V3：加入血清（漿）體積：0.1ml； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml； W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。

注意：*低檢測限為 0.01nmol/ml 或 0.01nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot