宿主細(xì)胞蛋白

宿主細(xì)胞蛋白（HCP， host cell protein）是宿主細(xì)胞表達(dá)的除目標(biāo)蛋白以外的其它蛋白的總稱。研究表明，一些HCP對(duì)抗體的免疫原性、穩(wěn)定性和抗體輔料的穩(wěn)定性有著較大的影響1。因此，生物制品從發(fā)酵到成品需要經(jīng)歷一系列純化步驟，用于去除HCP等非目標(biāo)組分。經(jīng)過了純化步驟后，殘留的HCP通常含量極低（1-100 ppm），但由于HCP的高風(fēng)險(xiǎn)性，即使其殘留量很低，仍然需要監(jiān)控。低含量的組分，尤其是存在于高濃度主體中的低含量組分的檢測(cè)是對(duì)分析技術(shù)的極大挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)表現(xiàn)在靈敏度、動(dòng)態(tài)范圍和選擇性等方面。

靈敏度和選擇性俱佳的ELISA（酶聯(lián)免疫吸附法）成為HCP檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但ELISA也存在一定的局限，例如稀釋不成線性、缺少HCP種類信息等。隨著LCMS在蛋白組學(xué)領(lǐng)域的成功使用，各大企業(yè)將LCMS引入到HCP的檢測(cè)中2-7，USP也在2023年將LCMS檢測(cè)方法引入通則，與ELISA法互為補(bǔ)充。本文系統(tǒng)介紹LCMS檢測(cè)HCP的樣品前處理、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理和泛HCP概念的應(yīng)用。

01

樣品前處理

如表1所示，HCP的前處理通常分為三類：標(biāo)準(zhǔn)酶解、去除主蛋白的酶解策略、富集HCP的前處理策略。這些前處理方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。通常情況下，抗體的酶解選擇native酶解法，也就是在pH 7-8的緩沖溶液中加入蛋白酶直接酶切（不做變性、還原和烷基化處理）。這個(gè)方法由Huang在2017年使用到NIST Mab的HCP檢測(cè)中，是一種簡(jiǎn)單有效的方法3。主要的原理是，在native條件下抗體的酶解是被限制的，而與抗體具有不同性質(zhì)的HCP可以酶解得到相應(yīng)的肽段，因此最終得到的酶解溶液中主蛋白的肽段濃度低于常規(guī)酶解。Native酶解和標(biāo)準(zhǔn)酶解所得肽譜對(duì)比如圖1所示。除了native酶解，還有國(guó)內(nèi)廠家使用磁珠法富集HCP。此外，對(duì)于非抗體類的重組蛋白，例如AAV，由于主蛋白的含量很低，native酶解并沒有顯著優(yōu)勢(shì)，可以嘗試標(biāo)準(zhǔn)酶解。為了實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品中HCP的全面檢測(cè)，有必要進(jìn)行多種前處理方法合并研究。

表1  HCP的LCMS檢測(cè)常見前處理方法

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圖1   native酶解與標(biāo)準(zhǔn)酶解的肽譜對(duì)比圖

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02

分離方法

HCP樣品的分離可以有多種方法，我們將這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比如表2所示。初期產(chǎn)品的研究，建議使用nanoLC-MS開展相關(guān)研。相對(duì)與UHPLC-MS，nanoLC-MS即使使用5 µm粒徑的色譜填料，靈敏度也可以高50-200倍，如果使用亞2µm的填料，可以獲得更高的靈敏度8。NanoLC-MS的高靈敏可以實(shí)現(xiàn)0.1 ppm HCP的檢測(cè)，這樣的靈敏度是常規(guī)液相（包括2DLC）無法實(shí)現(xiàn)的6。

表2 常見的HCP分離方法對(duì)比

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03

采集方法和分析軟件

常見的采集方法如表3所示。在產(chǎn)品的初期，建議使用DDA或者DIA的采集方法探索樣品中HCP的種類和大致含量，待產(chǎn)品成熟后可以轉(zhuǎn)為MRM/PRM的方法對(duì)特定的HCP進(jìn)行定量檢測(cè)。DDA和DIA的好處是可以同時(shí)監(jiān)測(cè)多種HCP的含量、包括目標(biāo)和非目標(biāo)HCP的檢測(cè)。MRM/PRM更傾向于目標(biāo)HCP的檢測(cè)?？梢詸z索DDA采集數(shù)據(jù)的軟件通常比DIA更多，如mascot、Proteome Discoverer （PD）、BioPharma Finder (BPF) 、pFind等。但隨著DIA的采集方法越來越成熟，可以支持DIA數(shù)據(jù)檢索的軟件也越來越多，例如PD、Spectronuat和DIA-NN等。需要注意的是，因?yàn)椴煌能浖ㄖ禈?biāo)準(zhǔn)不同，所以檢索的結(jié)果會(huì)存在差異，為了實(shí)現(xiàn)更為全面的HCP檢索，可以將不同軟件檢索的結(jié)果合并分析，最后選擇重點(diǎn)關(guān)注的HCP種類做深入研究。

表3 HCP常見的采集方法對(duì)比

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04

HCP的定量

HCP的定量可以選擇三種不同的方式，如表4所示。標(biāo)準(zhǔn)蛋白添加的方式可以同時(shí)定量多種HCP，但定量的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)肽段添加存在差異。標(biāo)準(zhǔn)蛋白添加的定量理論來源于Hi3原則，如公式1。得到HCP的物質(zhì)的量后，可以參考公式2計(jì)算HCP的含量。

表4 HCP的定量方法

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05

報(bào)告內(nèi)容

一份定性的HCP報(bào)告，需要包含HCP的種類、pI點(diǎn)和分子量。定量分析的HCP報(bào)告除了包含定性的內(nèi)容以外，還需要報(bào)告HCP的含量，例如ppm或者物質(zhì)的量。需要注意的是，因?yàn)長(zhǎng)CMS和ELISA的檢測(cè)原理不同，LCMS定量的單個(gè)HCP的含量之和與ELISA定量的HCP總量不具有換算關(guān)系。將兩種方法用于HCP的定量并非是為了統(tǒng)一，而是互為補(bǔ)充，當(dāng)其中任何一種方法檢測(cè)得到的HCP含量高都需要繼續(xù)研究。

當(dāng)報(bào)告產(chǎn)品中沒有HCP存在，需要提供檢測(cè)方法的靈敏度?？梢栽跇悠分刑砑拥鞍鬃鳛榉椒ǖ撵`敏度檢測(cè)。用于靈敏度和HCP定量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，需要純度、序列（包括修飾）和質(zhì)量已知。如果報(bào)告產(chǎn)品中存在HCP，需要提供檢測(cè)方法的carryover數(shù)據(jù)，也就是blank樣品中不應(yīng)該這些蛋白的檢出。此外，一旦確定樣品中含有HCP，需要用人為添加的方式做驗(yàn)證。

06

HCP概念的外延

LCMS檢測(cè)重組蛋白中HCP的種類和含量的思路來源于蛋白組學(xué)。蛋白組學(xué)的研究思路不僅可以用于HCP的分析，還可以用于其它非重組生物制品，例如天然提取生物制品的蛋白組成和含量分析9、病毒類疫苗10和細(xì)菌類疫苗11的蛋白組成分析等，為這些生物制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供思路。

小結(jié)與展望

無論什么樣本，只要想獲取可靠的HCP報(bào)告，必須具備兩個(gè)條件：

1）采集可靠的原始數(shù)據(jù)；

2）采用強(qiáng)大的軟件提供可靠的HCP報(bào)告內(nèi)容。

賽默飛的Orbitrap系列質(zhì)譜（QE、OE、Astral和三合一系列）深耕蛋白組學(xué)領(lǐng)域多年，受到蛋白組學(xué)客戶廣泛認(rèn)可。Orbitrap系列質(zhì)譜無論是靈敏度還是準(zhǔn)確性都為HCP等蛋白組學(xué)和亞蛋白組學(xué)的分析提供了可靠保證，減少HCP分析的假陽(yáng)性，同時(shí)為客戶提供深度HCP分析。賽默飛強(qiáng)大的組學(xué)分析軟件，不僅為HCP定性和定量分析提供報(bào)告內(nèi)容，還可以深度解析不同樣本間以及產(chǎn)品純化工藝過程中HCP的變化。賽默飛高通量定量質(zhì)譜Stellar，憑借其獨(dú)特的二級(jí)和三級(jí)掃描，實(shí)現(xiàn)蛋白組學(xué)和亞蛋白組學(xué)的高通量、高靈敏度、穩(wěn)定定量輸出。獲取更多信息，請(qǐng)聯(lián)系賽默飛當(dāng)?shù)劁N售工程師。

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