ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）的底物顯色原理基于酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化，通過這一變化實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分子的定性或定量檢測。以下是其核心原理的詳細(xì)說明：

1. 基本流程
- 抗原-抗體結(jié)合：目標(biāo)抗原被固定在固相載體（如微孔板）上，與特異性抗體結(jié)合。
- 酶標(biāo)記抗體：通過直接或間接法（如二抗）引入酶標(biāo)記的抗體（常用酶包括辣根過氧化物酶HRP、堿性磷酸酶AP等）。
- 底物反應(yīng)：加入無色底物，酶催化底物分解，生成有色產(chǎn)物。

2. 顯色反應(yīng)的關(guān)鍵步驟
(1) 酶的選擇與對應(yīng)底物
- HRP（辣根過氧化物酶）：
- 底物：TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）、OPD（鄰苯二胺）、ABTS（2,2'-聯(lián)氮雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）。
- 反應(yīng)原理：在過氧化氫（H?O?）存在下，HRP催化底物氧化。
- 例如，TMB被氧化后生成藍(lán)色產(chǎn)物（最大吸收波長450 nm），加入硫酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色（吸收波長450 nm）。
- 特點(diǎn)：靈敏度高、反應(yīng)快速，需酸性終止液。

- AP（堿性磷酸酶）：
- 底物：pNPP（對硝基苯磷酸酯）、BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/氮藍(lán)四唑）。
- 反應(yīng)原理：AP催化底物水解。
- pNPP水解生成黃色的對硝基苯酚（吸收波長405 nm）。
- BCIP/NBT生成藍(lán)色/紫色沉淀（適用于肉眼觀察或比色法）。
- 特點(diǎn)：反應(yīng)較溫和，無需終止液，適合長時間孵育。


(2) 顏色變化的定量分析
- 顯色產(chǎn)物的吸光度（OD值）與目標(biāo)分子濃度呈正相關(guān)，通過酶標(biāo)儀測量特定波長下的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)定量分析。


3. 其他類型底物
除了顯色底物，ELISA還可使用以下底物系統(tǒng)：
- 熒光底物：酶催化底物生成熒光物質(zhì)（如HRP催化Ampliflu Red），通過熒光酶標(biāo)儀檢測。
- 化學(xué)發(fā)光底物：酶催化底物產(chǎn)生光信號（如HRP催化魯米諾），通過化學(xué)發(fā)光儀檢測，靈敏度更高。


4. 關(guān)鍵影響因素
- 酶活性：溫度、pH、抑制劑可能影響酶反應(yīng)效率。
- 底物穩(wěn)定性：需避光保存（如TMB見光易分解）。
- 反應(yīng)時間：顯色時間過長可能導(dǎo)致背景信號升高。


5. 應(yīng)用場景
- 顯色底物（如TMB、pNPP）適用于常規(guī)ELISA檢測。
- 化學(xué)發(fā)光/熒光底物適用于高靈敏度檢測（如低豐度蛋白、細(xì)胞因子）。

通過這一原理，ELISA實(shí)現(xiàn)了對蛋白質(zhì)、抗體、病毒等生物分子的高特異性檢測，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、生物研究和藥物開發(fā)領(lǐng)域。