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酚氧化酶(PO)檢測|茁彩生物

來源:上海茁彩生物科技有限公司   2025年03月04日 10:48  

酚氧化酶(phenoloxidase,PO)是一種含銅的氧化酶,在生物的免疫防御、傷口愈合、色素形成等生理過程中發(fā)揮重要作用。

酚氧化酶能夠催化酚類物質(zhì)(如鄰苯二酚、L - 多巴等)氧化成醌類物質(zhì),醌類物質(zhì)進一步聚合形成有色的色素,通過測定反應(yīng)體系中生成的有色物質(zhì)在特定波長下的吸光度變化,來反映酚氧化酶的活性。不同的酚類底物在被酚氧化酶催化氧化后生成的產(chǎn)物顏色不同,且在不同波長下有最大吸收峰,例如鄰苯二酚氧化產(chǎn)物在 490nm 左右有吸收峰,L - 多巴氧化產(chǎn)物在 475nm 左右有吸收峰。

檢測步驟

樣本制備:

生物組織(如昆蟲的血淋巴、動物的組織器官等)中的酚氧化酶,需要先對樣本進行處理。以昆蟲血淋巴為例,用合適的抗凝劑(如含有PMSF的緩沖液)收集血淋巴,防止酚氧化酶在體外被激活而發(fā)生自氧化。若檢測的是組織中的酚氧化酶,則需要將組織勻漿,然后離心取上清液作為酶液,勻漿過程中可使用含有蛋白酶抑制劑的緩沖液,以保護酶的活性。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:配制一系列不同濃度的酚類底物的氧化產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)溶液(如醌類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液),在其最大吸收波長下測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活性測定:在反應(yīng)體系中加入一定量的酶液(上述制備的樣本上清液)、酚類底物溶液(如一定濃度的鄰苯二酚或 L - 多巴溶液)和緩沖液(如 pH 6.0-7.5 的磷酸緩沖液,維持反應(yīng)體系的 pH 穩(wěn)定),總體積根據(jù)實驗需求確定(如 1mL)。同時設(shè)置對照組,對照組中可加入經(jīng)熱處理使酶失活的酶液,其他成分與實驗組相同。將反應(yīng)體系置于適宜溫度(如 25℃或 37℃)的恒溫振蕩器中反應(yīng)一定時間(如 10-30 分鐘),然后加入適量的終止液(如強酸或強堿溶液使酶失活)終止反應(yīng)。

吸光度測定與結(jié)果計算:將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至比色皿中,在酚類底物氧化產(chǎn)物的最大吸收波長下,使用分光光度計測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出反應(yīng)體系中生成的氧化產(chǎn)物的量,再根據(jù)酶液的加入量、反應(yīng)時間、反應(yīng)體系體積等參數(shù),計算出酚氧化酶的活性,通常以單位時間內(nèi)生成一定量氧化產(chǎn)物所需的酶量來表示(如 U/mL)。


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