等溫滴定量熱法(Isothermal titration calorimetry，ITC) 是一種可以直接測(cè)量生物過(guò)程結(jié)合能量的技術(shù)，包括蛋白質(zhì)- 配體結(jié)合、蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA- 蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)- 碳水化合物結(jié)合、蛋白質(zhì)- 脂質(zhì)結(jié)合和抗原- 抗體結(jié)合。

ITC 儀器是一個(gè)根據(jù)動(dòng)態(tài)功率補(bǔ)償原理工作的熱通量熱量計(jì)，即它測(cè)量樣品和參比池之間保持恒定溫差（接近零）所需的功率量(μcal/sec)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是指將一種反應(yīng)物配制成澄清溶液放在一個(gè)溫控樣品池中，通過(guò)一個(gè)熱電偶回路與參比池偶聯(lián)，另一種反應(yīng)物作為配體置于注射器中。其中，樣品池和參比池通過(guò)絕熱裝置隔開(kāi)，但保持環(huán)境條件相同。在恒定溫度下，注射器以一定速度向樣品池中不斷滴加配體，注射器還具有攪拌功能，反應(yīng)一定時(shí)間，儀器測(cè)量樣品池的熱量變化并使其與參比池平衡，顯示為一個(gè)吸熱或放熱的峰。放熱反應(yīng)觸發(fā)恒溫功率的負(fù)反饋，而吸熱反應(yīng)則觸發(fā)恒溫功率的正反饋來(lái)保持溫度恒定。反饋系統(tǒng)降低或升高所施加的熱功率以補(bǔ)償這種溫度不平衡，每次注射后，系統(tǒng)達(dá)到平衡并恢復(fù)至恒定溫度。因此，記錄的信號(hào)顯示出峰值形式的典型偏轉(zhuǎn)模式（如圖1所示）。假設(shè)基線作為參考，對(duì)滴定峰進(jìn)行積分，就會(huì)得到相關(guān)的熱量。當(dāng)樣品池中的反應(yīng)物變得飽和時(shí)，熱信號(hào)減小直至僅背景熱。

圖1. 等溫滴定量熱儀的簡(jiǎn)略工作示意圖

等溫滴定量熱法 (ITC) 是一種高分辨率方法，用于完整表征相互作用的基本化學(xué)細(xì)節(jié)，通過(guò)自帶軟件對(duì)滴定結(jié)果進(jìn)行擬合、分析可得到測(cè)量熱力學(xué)性質(zhì)，包括：相互作用的化學(xué)計(jì)量學(xué)(n)、親和力常數(shù)(KD)、焓變化(?H)、熵變化(?S) 、吉布斯自由能(?G)和恒壓摩爾熱容(?Cp)。ITC 測(cè)量的是在自然狀態(tài)下無(wú)外力作用的結(jié)合伴侶間的親和力，無(wú)需使用熒光標(biāo)簽修飾組分或使樣品固定化。

酶的催化動(dòng)力學(xué)及抑制劑研究是酶學(xué)研究中非常重要的一個(gè)部分，得到的信息能夠預(yù)測(cè)催化反應(yīng)的路徑。等溫滴定量熱技術(shù)作為一種新興的測(cè)定方法，可以快速直接準(zhǔn)確測(cè)量化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的熱量變化。

廣西高校資源化工應(yīng)用新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廖丹葵課題組利用等溫滴定量熱儀NANO ITC（TA  Instrument）)測(cè)定肺血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）催化水解其體外模擬底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）反應(yīng)的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，考察了溫度對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。

圖2.不同溫度下ACE催化HHL水解反應(yīng)的等溫 滴定量熱曲線

圖3.不同溫度下ACE酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線

結(jié)果表明，該反應(yīng)的摩爾水解焓ΔHhydr為正值，是吸熱反應(yīng)，且隨溫度升高 ΔHhydr增大，等壓比熱容cp為 0.2126kJ/(mol·K)；ACE 催化 HHL 的水解反應(yīng)符合 Michaelis-Menten 機(jī)理，在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi)（298.15～313.15K），米氏常數(shù)Km隨溫度升高而減小，催化常數(shù)kcat隨溫度的升高先增大后減少，在308.15K時(shí)達(dá)到zui大值2.534s^?1。將該法與傳統(tǒng)的初始速率法進(jìn)行比較，傳統(tǒng)法存在的局限性使測(cè)得的 Km相對(duì)偏大。