JAG1-NOTCH4 mechanosensing drives atherosclerosis

KWS：JAG1-NOTCH4；mechanosensing；atherosclerosis

血流產(chǎn)生機(jī)械剪切應(yīng)力，通過改變血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的生理機(jī)能，對血管功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。具有均勻幾何形狀的動脈樹區(qū)域受到單向的高生理剪切應(yīng)力，發(fā)揮EC 保護(hù)作用并防止動脈粥樣硬化的發(fā)生。然而，動脈的分支和彎曲部分暴露于復(fù)雜的血流模式中，產(chǎn)生方向變化的低平均剪切應(yīng)力（如雙向振蕩和渦流），這些紊亂的血流條件會促進(jìn) EC 功能障礙和動脈粥樣硬化的發(fā)生。

Notch 信號通路在調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程、調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)方面起至關(guān)重要的作用。哺乳動物中有四個受體（Notch1-4）和五個配體（Delta-like（DLL）1，3，4和Jagged（Jag）1-2）。經(jīng)典研究表明，相鄰 EC 上 NOTCH1及其配體DLL4 之間的相互作用在血管生成過程中建立了“前端”與“柄”細(xì)胞身份，并且 NOTCH1 和 DLL4 通過抑制缺血組織中的 EC 增殖和新生血管形成對動脈功能至關(guān)重要。Notch 的激活需要配體內(nèi)吞作用誘導(dǎo)的機(jī)械力，而NOTCH1 對剪切應(yīng)力的感應(yīng)在動脈分化和血管穩(wěn)態(tài)保護(hù)中起重要作用。然而，Notch 系統(tǒng)在致動脈粥樣硬化擾動流的 EC 傳感中的潛在作用尚未得到研究。

基于此，英國謝菲爾德大學(xué)感染、免疫和心腦血管疾病系、中國西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院及美國芝加哥大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)系等研究團(tuán)隊曾利用幾種互補(bǔ)的實驗方法（豬動脈、實驗血流修飾的小鼠動脈和培養(yǎng)的人EC）表明了擾動流主要激活 JAG1-NOTCH4 通路。其條件性基因缺失表明，Jag1 特別是在易患病的血流紊亂區(qū)域增強(qiáng)動脈粥樣硬化；單細(xì)胞 RNA 測序和其他機(jī)制方法表明，JAG1-NOTCH4 信號通過抑制對增殖至關(guān)重要的 EC 亞群來促進(jìn)動脈粥樣硬化。這些數(shù)據(jù)從根本上推進(jìn)了我們對 Notch 信號在解釋剪切應(yīng)力信號控制 EC 功能中的作用的認(rèn)識，并對動脈粥樣硬化中 Notch 通路的治療靶向具有重要意義。研究成果發(fā)表在 Science Advances 期刊題為“JAG1-NOTCH4 mechanosensing drives atherosclerosis”。

實驗假設(shè) Notch 受體和配體在暴露于不同流動條件的動脈位置可能具有不同的空間表達(dá)模式，通過qRT-PCR分析對從暴露于受干擾的低振蕩剪切應(yīng)力（LOSS）或高剪切應(yīng)力（HSS）的區(qū)域分離的豬主動脈 EC 中 Notch 受體及其配體的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與 HSS 相比，JAG1 和 NOTCH4 mRNA 在 LOSS 位點的表達(dá)顯著增強(qiáng)，而 JAG2、DLL1、DLL3、DLL4、NOTCH1、NOTCH2 和 NOTCH3 的表達(dá)在這些位點之間相似（圖1 A）。

然后，量化小鼠主動脈弓中 JAG1 和 NOTCH4 蛋白的表達(dá)。表面染色顯示，與小鼠主動脈弓中的 HSS 區(qū)域相比，JAG1 和 NOTCH4 蛋白在 LOSS 區(qū)域的表達(dá)水平更高（圖1 B、C）。利用免疫熒光光片成像技術(shù)對高膽固醇血癥載脂蛋白E（ApoE）-/- 小鼠的病變動脈區(qū)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與相鄰的非斑塊區(qū)域相比，JAG1 和 NOTCH4 在動脈粥樣硬化斑塊區(qū)域富集，表明其在動脈粥樣硬化中具有潛在作用（圖1 D）。這些數(shù)據(jù)表明，JAG1 和 NOTCH4 在動脈粥樣硬化易感部位的內(nèi)皮細(xì)胞和動脈粥樣硬化斑塊中富集。

使用收縮袖帶改變小鼠頸動脈的血流在下游產(chǎn)生振蕩剪切應(yīng)力，評估JAG1 和 NOTCH4 是否直接對剪切應(yīng)力敏感，結(jié)果顯示，14 天后下游區(qū)域的 JAG1 和 NOTCH4 顯著增強(qiáng)（圖1 E、F）。相比之下，JAG1 和 NOTCH4 的表達(dá)在具有生理血流的對側(cè)動脈中幾乎檢測不到。因此，JAG1 和 NOTCH4 在袖帶內(nèi)曲率和下游區(qū)域的富集可能是對 LOSS 的反應(yīng)。

圖1    JAG1和NOTCH4在動脈粥樣硬化傾向位點富集。

進(jìn)一步地，分析人冠狀動脈EC（HCAEC）對血流（LOSS：±4 dyne/cm2，0.5 Hz；HSS，13 dyne/cm2）的反應(yīng)。Notch 配體 JAG1、JAG2、DLL3 和 DLL4 的 mRNA 水平因 HCAEC 中的剪切應(yīng)力而顯著改變，其中 JAG1 在 LOSS 下表達(dá)最高（圖2 A）。此外，JAG1 是在蛋白質(zhì)水平上持續(xù)被 LOSS 增強(qiáng)的 Notch 配體（圖2 B），但DLL4 蛋白未受流動影響（圖2 B）。在 Notch 受體中，NOTCH4 在 mRNA（圖2 A）和蛋白質(zhì)（圖2 C）水平上都因 LOSS 而增強(qiáng)，這與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增加有關(guān)，NOTCH4活性和裂解的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（N4ICD）增加證明了這一點（圖2 C、D）。暴露于靜態(tài)條件下的 HCAEC 中的 JAG1 和 NOTCH4 mRNA 水平較低，證實它們具有流動響應(yīng)性。這些數(shù)據(jù)表明，JAG1 和 NOTCH4 是暴露于 LOSS 的人 EC 中的主要 Notch 成分，這與體內(nèi)研究一致。

此外，使用 JAG1 的活性阻斷抗體和 DLL4 阻斷抗體作為對照進(jìn)行比較，研究了 JAG1 是否在 LOSS 下作用于 NOTCH4 的上游。在暴露于 LOSS 的 HCAEC 中，阻斷 JAG1 顯著降低了 N4ICD 激活，而阻斷 DLL4 活性沒有顯著影響（圖2 E）。anti-JAG1 或 anti-DLL4 阻斷抗體未改變 NOTCH4 mRNA 的總水平。這些數(shù)據(jù)表明，JAG1 激活NOTCH4 是 LOSS 條件下的關(guān)鍵通路。

圖2   JAG1-NOTCH4通路是由LOSS體外誘導(dǎo)的。

接下來，為了描述內(nèi)皮 Jag1 在動脈粥樣硬化中的作用，生成 EC 特異性Jag1 敲除小鼠，并暴露于高脂飲食產(chǎn)生高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化病變（圖3 A、B）。在高膽固醇血癥小鼠中，與對照組相比，Jag1^ECKO 小鼠整個主動脈的病變面積顯著減少（圖3 C、D）。進(jìn)一步分析顯示，Jag1^ECKO  導(dǎo)致主動脈弓病變面積減少，但降主動脈（圖3 D）病變面積未減少，主動脈根部的病變區(qū)域也沒有改變（圖3 E、F）。因此，Jag1 在具有特定流動條件的解剖學(xué)不同部位上促進(jìn)動脈粥樣硬化，尤其是在血流紊亂部位。

圖3   內(nèi)皮細(xì)胞Jag1的缺失減少了主動脈弓斑塊的形成。

最后，為了闡明 JAG1 依賴性動脈粥樣硬化的潛在機(jī)制，對對照和Jag1ECKO 主動脈進(jìn)行scRNA-seq。SORT-seq 分析確定了 14 個不同的集群。其中，簇 0-11 一致表達(dá)多種 EC 標(biāo)志物，與以前發(fā)表的小鼠主動脈的 EC 簇非常相似。這些觀察結(jié)果證實了正常小鼠主動脈中存在異質(zhì)性。簇 4-6 中的大多數(shù)細(xì)胞來自 Jag1ECKO 小鼠，而簇 2 和 7-11 的細(xì)胞主要來自對照小鼠，表明 Jag1 對 EC 異質(zhì)性有深遠(yuǎn)的影響。特別是，與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的多個 GO terms 在 Jag1ECKO 小鼠富集，表明 Jag1 抑制參與增殖和遷移的 EC 亞型。

然后，分析了體外暴露于 LOSS 的 HCAEC 中的 JAG1 功能。RNA-seq 顯示 859 個基因因抑制 JAG1 而顯著改變，DAVID功能注釋發(fā)現(xiàn)，最高度富集的 GO terms 集中在細(xì)胞分裂過程和細(xì)胞分裂/遷移（圖4 A-C）。因此，確定 JAG1 是 EC 增殖的調(diào)節(jié)因子。通過使用基因沉默或活性阻斷抗體抑制 JAG1-NOTCH4 通路可顯著增強(qiáng) LOSS 下的 HCAEC 增殖和遷移，證實了這一聯(lián)系（圖4 D、E）。此外，pan-Notch 抑制劑DAPT 增強(qiáng)了暴露于 LOSS 的 HCAEC 的增殖，這與 JAG1 水平降低相關(guān)，而 DLL4 沒有改變，從而進(jìn)一步證實了擾動流下 JAG1、Notch 與增殖之間的聯(lián)系。同樣，Jag1 的缺失導(dǎo)致暴露于 LOSS 的小鼠主動脈區(qū)域的 EC 增殖增加（圖4 F），但不影響暴露于 HSS 的區(qū)域的 EC 增殖。因此，JAG1-NOTCH4 通路在擾動流下抑制了增殖和遷移。

為了研究 JAG1 的作用是否具有細(xì)胞自主性，分析了 JAG1 沉默細(xì)胞是否可以影響共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理細(xì)胞的增殖均顯著增強(qiáng)，表明 JAG1 通過非細(xì)胞自主機(jī)制驅(qū)動增殖，其機(jī)制可能涉及細(xì)胞間接觸。這些數(shù)據(jù)表明，JAG1-NOTCH4 的LOSS 感應(yīng)通過改變 EC 異質(zhì)性以抑制控制增殖和遷移的 EC 亞群來增強(qiáng)疾病易感性。

圖4    LOSS激活JAG1導(dǎo)致內(nèi)皮修復(fù)受到抑制。

圖5    動脈粥樣硬化中JAG1-NOTCH4 控制修復(fù)性內(nèi)皮亞群的假設(shè)。

實驗假設(shè) LOSS 激活 JAG1-NOTCH4 信號，通過改變修復(fù)性和致病性 EC 亞群的平衡來促進(jìn)動脈粥樣硬化。

總之，JAG1-NOTCH4 對 LOSS 的感應(yīng)通過改變 EC 異質(zhì)性促進(jìn)動脈粥樣硬化，實驗假設(shè)該通路抑制了負(fù)責(zé)血管修復(fù)的亞群。這些數(shù)據(jù)表明，JAG1-NOTCH4 在感知疾病引發(fā)的 LOSS 中具有重要作用，并表明 JAG1-NOTCH4 的治療靶向可能是一種新的治療策略，可增強(qiáng)修復(fù)性 EC 亞群以預(yù)防或治療動脈粥樣硬化。

參考文獻(xiàn)：Souilhol C, Tardajos Ayllon B, Li X, Diagbouga MR, Zhou Z, Canham L, Roddie H, Pirri D, Chambers EV, Dunning MJ, Ariaans M, Li J, Fang Y, J?rgensen HF, Simons M, Krams R, Waltenberger J, Fragiadaki M, Ridger V, De Val S, Francis SE, Chico TJ, Serbanovic-Canic J, Evans PC. JAG1-NOTCH4 mechanosensing drives atherosclerosis. Sci Adv. 2022 Sep 2;8(35):eabo7958. doi: 10.1126/sciadv.abo7958. Epub 2022 Aug 31. PMID: 36044575; PMCID: PMC9432841.

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