校正染料 (ROX)

校正加樣誤差或孔與孔之間的誤差，提供一個穩(wěn)定的基線，極大地改進定量的精確 度，提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。

注意：不同的儀器對 ROX 的需求不同。

基線

PCR 的最初幾個循環(huán)，在 此基線上熒光信號幾乎沒有變化。

閾值

可以相信的最小熒光值。

CT 值

擴增曲線與閾值交點的橫坐標(biāo)。

二、結(jié)果有效性判斷

融解曲線單峰 ( 染料法 )

擴增曲線指數(shù)擴增區(qū)域，復(fù)孔間 CT 值 STD<0.2

閾值設(shè)置合理

閾值位于指數(shù)增長期：儀器會自動計算閾值，但并非所有情況下儀器計算結(jié)果都是 合理的，必要時進行手動調(diào)整。

NTC 確認(rèn)無氣溶膠污染或可以忽略

NTC = No Template Control (qPCR 反應(yīng)，模板以水代替 )；

若 ΔCT=NTC (CT 值 ) - 目的基因 (CT 值 ) ≥3 或 ≥5，可認(rèn)為體系中氣溶膠污染不會 影響到實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

NRT 確認(rèn)無基因組殘留或可以忽略

NRT=No RT Control ( 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，除逆轉(zhuǎn)錄酶組分，其余組分正常添加 )；

若 ΔCT=NRT (CT 值 ) - 目的基因 (CT 值 ) ≥3 或 ≥5，可認(rèn)為體系中基因組殘留不會 影響到實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

待測 CT 值于線性范圍內(nèi)

擴增效率符合近似計算標(biāo)準(zhǔn)

PCR 擴增效率 (e) 介于 90%-120% 之間

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