“信使核糖核酸（mRNA）療法在治療由遺傳突變、慢性感染、藥物和酒精濫用以及嚴(yán)重創(chuàng)傷等引起的肝臟疾病方面具有巨大潛力，每年全球有超過200萬人死于這些肝臟疾病。肝臟遺傳代謝疾病特別適合基于mRNA的蛋白質(zhì)替代療法和基因編輯。然而，廣泛使用的聚乙二醇化（PEGylated）藥物和脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）會(huì)引發(fā)抗PEG（anti-PEG）抗體，從而在重復(fù)給藥時(shí)阻礙治療效果。為解決這一問題，研究人員設(shè)計(jì)、合成并優(yōu)化了一系列聚合物脂質(zhì)，以替代目前使用的1,2-二肉豆蔻?；?rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2000），旨在減少anti-PEG antibodies (APAs)反應(yīng)性，提高重復(fù)給藥療效。”
化學(xué)設(shè)計(jì)與合成
研究人員通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）技術(shù)，合成了具有高密度刷狀結(jié)構(gòu)的聚合物脂質(zhì)（brush-shaped poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (PEGMA) lipids (BPLs) ）。這些聚合物脂質(zhì)的參數(shù)，包括側(cè)鏈長度、聚合度、錨鏈長度和表面結(jié)構(gòu)，可以調(diào)節(jié)抗PEG抗體結(jié)合親和力，并控制LNPs的血液藥代動(dòng)力學(xué)。與廣泛使用的DMG-PEG2000相比，含有刷狀聚合物脂質(zhì)的LNPs在蛋白質(zhì)替代療法和基因組編輯模型中產(chǎn)生了更佳的治療效果，為PEG脂質(zhì)替代品的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系提供了新的見解。具體來說，研究人員首先合成了具有不同側(cè)鏈長度的DMG-PEGxMA物種（x=1, 2, 3, 5, 9, 19），這些物種共享相同的脂質(zhì)起始劑DMG和相似的聚合度，但側(cè)鏈長度不同。通過動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測量發(fā)現(xiàn)，隨著側(cè)鏈長度的增加，LNPs的尺寸逐漸減小并趨于穩(wěn)定，當(dāng)側(cè)鏈長度達(dá)到5時(shí)，尺寸急劇減小并穩(wěn)定在約120nm，這與DMG-PEG2000相似，適合用于體內(nèi)研究。冷凍透射電子顯微鏡（cryo-TEM）圖像顯示，BPL LNPs與DMG-PEG2000 LNPs的結(jié)構(gòu)相似，表明BPL LNPs具有良好的穩(wěn)定性和mRNA封裝效率（>90%），并且具有較低的細(xì)胞毒性。
結(jié)果與分析
2.1 聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)mRNA遞送效率的影響：
為了確定是否可以使用具有替代化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)的合成聚合物作為DMG-PEG2000在LNPs中的替代品，研究人員設(shè)計(jì)了一系列具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的聚合物脂質(zhì)。通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)聚合物脂質(zhì)穩(wěn)定化的LNPs能夠遞送mRNA，但效率不同。在體內(nèi)遞送中，只有約40%的LNPs能夠?qū)崿F(xiàn)有效的mRNA遞送。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)鏈長度較長的BPL LNPs（如DMG-PEG19MA36）在體內(nèi)mRNA遞送效率方面表現(xiàn)最佳，這可能是因?yàn)檩^長的側(cè)鏈提供了更好的水溶性和穩(wěn)定性，有助于LNPs的形成和mRNA的封裝。具體來說，DMG-PEG19MA36 BPL LNPs在小鼠肝臟中產(chǎn)生了最高的熒光信號(hào)和人紅細(xì)胞生成素（hEPO）水平，表明其在mRNA遞送方面的更高效性。
圖1. 合成聚合物與脂質(zhì)融合的納米顆粒實(shí)現(xiàn)高效的mRNA遞送。
2.2 聚合物結(jié)構(gòu)與mRNA遞送效率的關(guān)系：
通過精確控制聚合物的架構(gòu)，研究人員考察了側(cè)鏈長度、聚合度和錨鏈長度對(duì)mRNA遞送效率的影響。結(jié)果表明，側(cè)鏈長度的增加有助于LNPs的形成和穩(wěn)定性，且隨著側(cè)鏈長度的增加，LNPs的尺寸減小并趨于穩(wěn)定。聚合度的增加也會(huì)提高mRNA遞送效率，但過高的聚合度可能會(huì)抑制細(xì)胞攝取和mRNA的釋放。錨鏈長度對(duì)LNPs的穩(wěn)定性和mRNA遞送效率也有重要影響，中等長度的錨鏈（如n=10,12）能夠提供適當(dāng)?shù)氖杷嗷プ饔茫龠M(jìn)LNPs的穩(wěn)定性和mRNA的高效遞送。具體來說，DMG-PEG19MAy（y=5, 10, 21, 36, 60, 77）的聚合度研究發(fā)現(xiàn)，隨著聚合度的增加，mRNA遞送效能先增加后減少，峰值出現(xiàn)在聚合度為36時(shí)。這表明存在一個(gè)最佳的聚合度范圍，既能提供足夠的穩(wěn)定性和遞送效率，又不會(huì)過度抑制細(xì)胞攝取和mRNA釋放。
圖2：通過合成化學(xué)調(diào)控聚合物結(jié)構(gòu)及其對(duì)mRNA傳遞效率的影響。
2.3 BPL LNPs減少APA結(jié)合并延長血液循環(huán)時(shí)間：
所有BPL LNPs均表現(xiàn)出比DMG-PEG2000 LNPs更少的蛋白吸附，這歸功于其梳狀結(jié)構(gòu)，有助于延長血液循環(huán)時(shí)間。通過藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，BPL LNPs的血液循環(huán)時(shí)間比線性DMG-PEG2000 LNPs更長，且隨著側(cè)鏈長度的增加，循環(huán)時(shí)間進(jìn)一步延長。然而，聚合度的增加會(huì)導(dǎo)致循環(huán)時(shí)間減少，這可能與從蘑菇到刷子結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變有關(guān)。此外，錨鏈長度也會(huì)影響蛋白介導(dǎo)的清除，較長的錨鏈有助于延長LNPs的循環(huán)時(shí)間。具體來說，BPL LNPs的Flory半徑（RF）值表明其側(cè)鏈處于刷子狀態(tài)，而聚合物主鏈的RF值則隨著聚合度的增加從蘑菇狀態(tài)過渡到刷子狀態(tài)。這種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變影響了LNPs表面的蛋白質(zhì)吸附和抗體結(jié)合親和力，從而影響了其血液循環(huán)時(shí)間和免疫原性。
圖 3. 聚合參數(shù)與聚合物狀態(tài)對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)特征及APA結(jié)合具有調(diào)控作用。
2.4 BPL LNPs在重復(fù)給藥方案中的表現(xiàn)：
為了驗(yàn)證聚合物脂質(zhì)架構(gòu)和表面結(jié)構(gòu)對(duì)重復(fù)給藥療效的影響，研究人員進(jìn)行了重復(fù)給藥實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與DMG-PEG2000 LNPs相比，BPL LNPs在重復(fù)給藥后能夠維持更穩(wěn)定的mRNA遞送效率。結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究表明，側(cè)鏈長度、聚合度和錨鏈長度都會(huì)影響重復(fù)給藥的療效。具體來說，側(cè)鏈長度較長的BPL LNPs在重復(fù)給藥后的遞送效率下降幅度較小，而聚合度較高的BPL LNPs則表現(xiàn)出較大的遞送效率下降。錨鏈長度對(duì)重復(fù)給藥療效的影響較小，這可能是因?yàn)椴煌腻^鏈長度具有相似的聚合度和側(cè)鏈長度。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在重復(fù)給藥后，BPL LNPs組的小鼠血清中抗PEG IgG和IgM水平顯著低于DMG-PEG2000 LNPs組，表明BPL LNPs能夠有效減少免疫反應(yīng)，從而維持其遞送效率。
圖4. 在重復(fù)給藥方案的研究中，BPL LNPs 的表現(xiàn)顯著優(yōu)于 DMG-PEG2000 LNPs。
2.5 BPL LNPs克服APA抑制效應(yīng)：
為了進(jìn)一步驗(yàn)證BPL LNPs在存在APA的情況下是否能夠維持療效，研究人員進(jìn)行了再挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。首先給小鼠注射DMG-PEG2000 LNPs以產(chǎn)生APA，30天后再次注射BPL LNPs或DMG-PEG2000 LNPs。結(jié)果顯示，BPL LNPs能夠延長血液循環(huán)時(shí)間，降低APA水平，并在第二次給藥后表現(xiàn)出更高的mRNA遞送效率。特別是某些BPL LNPs（如DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36）在第二次給藥后表現(xiàn)出優(yōu)于DMG-PEG2000 LNPs的mRNA遞送效率，表明其能夠有效克服APA的抑制效應(yīng)。具體來說，DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36 BPL LNPs在第二次給藥后，肝臟中的熒光信號(hào)和hEPO水平顯著高于DMG-PEG2000 LNPs組，表明其在克服APA抑制方面具有顯著優(yōu)勢。
圖5. BPL LNPs 可有效克服由 DMG-PEG2000 LNPs 引發(fā)的 APA 抑制效應(yīng)。
蛋白質(zhì)替代療法與基因組編輯
3.1 BPL LNPs在蛋白質(zhì)替代療法中的應(yīng)用：
研究人員使用Fah基因敲除（FAH?/?）小鼠模型，比較了BPL LNPs和DMG-PEG2000 LNPs在mRNA基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)替代療法中的效果。首先驗(yàn)證了BPL LNPs和DMG-PEG2000 LNPs在體外和體內(nèi)的mRNA遞送能力，結(jié)果顯示兩者均能有效表達(dá)FAH蛋白。為了模擬臨床場景，研究人員在開始蛋白質(zhì)替代療法前30天給FAH?/?小鼠注射DMG-PEG2000 LNPs以產(chǎn)生APA。然后，小鼠每三天接受一次LNP治療，持續(xù)33天。結(jié)果顯示，接受DMG-PEG19MA36 BPL LNPs治療的小鼠存活率顯著提高，F(xiàn)AH蛋白表達(dá)水平也顯著高于接受DMG-PEG2000 LNPs治療的小鼠。此外，BPL LNPs治療組的膽紅素水平顯著降低，表明其在改善肝臟功能方面具有更好的效果。具體來說，在治療結(jié)束時(shí)，100%接受DMG-PEG19MA36 BPL LNPs治療的小鼠存活，而只有37.5%接受DMG-PEG2000 LNPs治療的小鼠存活。西方印跡分析顯示，DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36 BPL LNPs治療組的FAH蛋白表達(dá)水平顯著高于DMG-PEG2000 LNPs治療組，表明其在蛋白質(zhì)替代療法中的更高效性。
3.2 BPL LNPs在基因組編輯中的應(yīng)用：
研究人員進(jìn)一步研究了BPL LNPs在體內(nèi)基因組編輯中的遞送能力，以PCSK9基因?yàn)榘悬c(diǎn)，該基因與血液膽固醇水平調(diào)節(jié)有關(guān)。結(jié)果顯示，DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36 BPL LNPs在肝臟中誘導(dǎo)了更高的插入和缺失（indels）效率，而DMG-PEG2000 LNPs的效率較低。進(jìn)一步的基因組測序分析表明，BPL LNPs治療組的indels效率是DMG-PEG2000 LNPs治療組的三倍。此外，BPL LNPs治療組的PCSK9蛋白水平在肝臟和血清中均顯著降低，而DMG-PEG2000 LNPs治療組的降低幅度較小。具體來說，DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36 BPL LNPs治療組的PCSK9蛋白水平在肝臟中降低了約100%，而在血清中降低了約70%，而DMG-PEG2000 LNPs治療組的PCSK9蛋白水平在肝臟中僅降低了約60%，在血清中降低了約40%。這些結(jié)果表明，BPL LNPs在體內(nèi)基因組編輯中具有更高的效率和更好的治療潛力。
圖6. BPL LNPs 在蛋白質(zhì)替代療法和基因組編輯應(yīng)用中展現(xiàn)了良好的治療效果。
結(jié)論與展望
本研究表明，聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)和架構(gòu)控制著納米-生物界面，這為開發(fā)具有抗污染能力、肝外遞送能力和LNP制劑工程的新型聚合物提供了新的思路。進(jìn)一步擴(kuò)展具有抗污染能力的聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)，將有助于深入理解LNP相關(guān)的免疫反應(yīng)和疾病特異性細(xì)胞效應(yīng)。研究人員預(yù)計(jì)，所報(bào)道的多功能聚合物脂質(zhì)將支持穩(wěn)健和持久的重復(fù)給藥方案，并可能在多種療法中找到有意義的應(yīng)用。未來的研究將集中在進(jìn)一步優(yōu)化聚合物脂質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和架構(gòu)，以提高其在不同疾病模型中的療效和安全性。同時(shí)，研究人員還將探索BPL LNPs在其他疾病治療中的應(yīng)用潛力，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病等，為這些疾病的治療提供新的策略和方法。
參考文獻(xiàn)：Xiao Y, Lian X, Sun Y, Sung YC, Vaidya A, Chen Z, Gupta A, Chatterjee S, Zheng L, Guerrero E, Wang X, Farbiak L, Yang Y, Diamond MI, Leal C, McDonald JG, Siegwart DJ. High-density brush-shaped polymer lipids reduce anti-PEG antibody binding for repeated administration of mRNA therapeutics. Nat Mater. 2025 Feb 28. doi: 10.1038/s41563-024-02116-3. Epub ahead of print. PMID: 40021827.
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