前言

類器官已成為生命科學和醫(yī)學研究領域的“明星模型”，在疾病機制研究、藥物篩選、精準醫(yī)療等方面展現(xiàn)出巨大潛力。然而，許多科研人員在嘗試類器官培養(yǎng)時，常常面臨“無法形成結構”、“細胞活性低”、“傳代失敗”等問題。

探究其根本，培養(yǎng)體系中細胞因子的選擇和配比可能是成敗的關鍵！

接下來，我們將會結合類器官經(jīng)典培養(yǎng)方案WENR（Wnt3a、EGF、Noggin、R-Spondins），解析“四大護法”如何各顯神通，助你攻克類器官培養(yǎng)難關！

01 WENR何以成為類器官培養(yǎng)經(jīng)典？

類器官的經(jīng)典培養(yǎng)方案WENR（或稱為WNER）最初由荷蘭Hubrecht研究所的Hans Clevers團隊開發(fā)，其核心成分包括Wnt-3a、EGF、Noggin和R-Spondins。常被稱為類器官培養(yǎng)的“四大護法”。

WENR方案在類器官的研究與實踐中不斷演化，通過與其他細胞因子或小分子抑制劑的巧妙結合，衍生出適用于多種類器官構建的培養(yǎng)條件。目前，WENR方案已在胃、小腸、結腸、胰腺、肝臟等多種類器官培養(yǎng)中得到廣泛應用。

WENR方案用于多種類器官培養(yǎng)（源自Bindi M. Doshi, PhD.）

02 WENR“四大護法”

1 Wnt-3a：干細胞增殖的“發(fā)動機”

Wnt-3a作為經(jīng)典Wnt通路的激活劑，通過穩(wěn)定β-catenin蛋白，啟動下游靶基因（如c-Myc、Cyclin D1），參與細胞發(fā)育、增殖和分化過程。Alessandra Merenda在其綜述中深入總結了Wnt信號通路在類器官領域的關鍵作用。文中指出，無論成體干細胞組織來源如何，其衍生的類器官在增殖、干性維持及終末分化特化細胞等關鍵環(huán)節(jié)，都依賴于經(jīng)典Wnt信號通路。如在小鼠結腸類器官的建立過程中，添加外源性Wnt-3a對其增殖至關重要。不添加Wnt-3a，類器官超過3天后無法存活。

Wnt-3a在腸類器官中培養(yǎng)中的作用（源自文獻：doi: 10.1016/j.tcb.2019.10.003）

2 EGF：細胞增殖的“加速器”

表皮生長因子（EGF）與受體結合，激活MAPK/ERK通路，促進細胞增殖和存活。EGF刺激上皮細胞增殖、血管生成和表皮細胞分化，促進類器官三維結構的形成。EGF廣泛應用于胃腸道、肝臟、甲狀腺等類器官培養(yǎng)，促進細胞集落形成和組織結構穩(wěn)定性。盡管EGF并非類器官形成的必需因子，但能顯著增加類器官體積。

優(yōu)化的WENR方案在人胃腸道類器官構建過程中的應用（源自文獻：doi: 10.1186/s13619-020-00040-w）

3 Noggin：抑制分化的“守門員”

在類器官構建過程中，Noggin與細胞增殖密切相關。Noggin是一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）的內源性抑制劑，通過阻斷BMP與受體結合，促進干細胞增殖，為類器官形成提供充足的細胞。Noggin還通過抑制BMP信號通路，維持干細胞干性，影響細胞的命運決定和分化過程。

在類器官培養(yǎng)中，Noggin常與Wnt-3a和R-Spondins一起使用，以平衡BMP和Wnt信號通路，促進類器官的生長和分化。因此，Noggin在類器官培養(yǎng)中不僅促進增殖，還精細調控細胞的分化。

Noggin抑制細胞增殖的分子機制（源自文獻：doi: 10.1242/bio.20149977）

4 R-Spondins：Wnt信號的“放大器”

R-spondin是Wnt信號通路的激活劑，通過與Frizzled和LRP5/6受體結合，增強Wnt信號在多種組織中的表達，促進干細胞增殖與類器官結構形成。T. Thalheim等人發(fā)現(xiàn)，沒有R-spondin時，類器官在4-5天后停止生長。在1.2% R-spondin濃度下培養(yǎng)的類器官生長非常迅速，生長時間超過5天后經(jīng)常破裂，其管腔內積累了大量細胞碎片。在10%或25% R-spondin濃度下培養(yǎng)的類器官生長速度比1.2%稍慢，但不會破裂。

不同濃度的R-spondin影響腸類器官的生長狀態(tài)（源自文獻：doi: 10.1016/j.ydbio.2017.10.013）

03 WENR實戰(zhàn)避坑Tips

Wnt過度激活會導致類器官結構紊亂，因此Wnt-3a濃度需嚴格控制。并且R-spondin需要和Wnt-3a協(xié)同使用，單獨使用效果有限。建議根據(jù)類器官類型優(yōu)化Wnt-3a的濃度，一般為50-100 ng/mL。在培養(yǎng)后期也可以動態(tài)調控其濃度。

EGF易被蛋白酶降解，建議使用無血清培養(yǎng)基。EGF長期高濃度，可能會誘導異常分化，建議定期更換培養(yǎng)基。EGF一般使用濃度為50 ng/mL。在腫瘤類器官（如腸癌）中，其濃度需根據(jù)癌細胞特性調整。

Noggin與Wnt-3a協(xié)同作用，支持胃、腸道、肝臟、肺、胰腺等類器官的長期培養(yǎng)。在肺類器官培養(yǎng)中，Noggin缺失會導致肺泡上皮細胞過早分化。在肝類器官中，其與Wnt3a的“雙劍合璧”是長期傳代的關鍵。BMP信號的過度激活會導致類器官形成囊狀結構，失去功能性隱窩結構。

S-spondin有4個亞型（RSPO1-4），不同組織來源的類器官可能需特異性選擇。Wnt-3a和R-spondin易失活，建議分裝后-80℃保存。

常見問題排查表，僅供參考：

?義翹神州WENR系列細胞因子

義翹神州開發(fā)的高質量WENR系列細胞因子，具有低內毒素、高批間一致性、高生物活性等特點，滿足您的多種類器官培養(yǎng)需求。

★：GMP級細胞因子，現(xiàn)貨供應！

【參考文獻】

1、 Nick Barker, et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 2010. doi: 10.1016/j.stem.2009.11.013.

2、 Toshiro Sato, Hans Clevers. SnapShot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 2015. doi: 10.1016/j.cell.2015.06.028.

3、Bindi M. Doshi, PhD. Crucial Niche Factors for Organoid Cultures. 

4、JuneSung Bae, et al. The Patient-Derived Cancer Organoids: Promises and Challenges as Platforms for Cancer Discovery. Cancers (Basel). 2022. doi: 10.3390/cancers14092144.

5、Alessandra Merenda, Nicola Fenderico, Madelon M Maurice. Wnt Signaling in 3D: Recent Advances in the Applications of Intestinal Organoids. Trends Cell Biol, 2020. doi: 10.1016/j.tcb.2019.10.003.

6、Zhang, M., Liu, Y. & Chen, YG. Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications. Cell Regen, 2020. doi.org/10.1186/s13619-020-00040-w

7、Kimberly A Wong, et al. Efficient retina formation requires suppression of both Activin and BMP signaling pathways in pluripotent cells. Biol Open, 2015. doi: 10.1242/bio.20149977.

8、Torsten Thalheim, et al. Linking stem cell function and growth pattern of intestinal organoids. Developmental Biology, 2018. doi.org/10.1016/j.ydbio.2017.10.013