冠狀病毒以其多樣的受體和復(fù)雜的感染機制，給科學(xué)家們帶來了巨大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的研究方法依賴于已知的受體和感染模型，但對于那些尚未明確受體的冠狀病毒，這種方法顯得力不從心。此外，冠狀病毒的快速變異能力使得研究和防控工作更加困難。

CVRs的設(shè)計基于“樂高積木”的模塊化設(shè)計思路，通過構(gòu)建人工受體框架（ARSs）和特定的病毒結(jié)合域（VBDs），實現(xiàn)了對冠狀病毒的特異性識別和結(jié)合。這種設(shè)計不僅能夠模擬天然受體的功能，還能夠根據(jù)需要進行調(diào)整和優(yōu)化，以適應(yīng)不同的研究和應(yīng)用場景。

圖1.CVRs的模塊化設(shè)計策略示意圖及其技術(shù)潛在應(yīng)用（圖片來自原文）

研究團隊通過一系列實驗，確定了CVRs功能性模仿天然受體的關(guān)鍵因素。首先，研究者們創(chuàng)建了四個hACE2嵌合蛋白，用微蛋白LCB1或LCB3逐步替換ACE2的頭部到頸部域，通過真實的SARS-CoV-2感染實驗，證明這些嵌合蛋白有效地支持病毒感染，且促進偽病毒進入的能力會隨著ACE2的縮短而逐漸減弱（如圖2 d所示）。通過實驗確定了影響CVRs功能性的關(guān)鍵因素，包括VBD與病毒刺突蛋白的結(jié)合親和力、CVRs在細(xì)胞表面的表達(dá)水平、以及CVRs誘導(dǎo)病毒刺突蛋白構(gòu)象變化的能力。

圖2.解析ACE2序列對其病毒受體功能的重要性（圖片來自原文）

接著，研究員利用22種已知的SARS-CoV-2中和抗體，這些抗體覆蓋了一系列中和表位，將它們轉(zhuǎn)換成基于scFv（單鏈可變片段）的病毒結(jié)合域（VBDs），從而構(gòu)建了44個CVRs。除了76E1納米抗體（它識別的表位在受體結(jié)合后才會暴露）之外，所有CVRs在系統(tǒng)中都表現(xiàn)出良好的表達(dá)，并且能夠有效地結(jié)合到SARS-CoV-2的刺突蛋白三聚體上（如圖3所示）。

圖3.結(jié)合表位對受體功能的影響（圖片來自原文）

之后，研究者們通過S2L20-CVR（定制化冠狀病毒受體）來促進SARS-CoV-2（嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2）的進入，并且證明這種進入是通過刺突蛋白的N末端域（NTD）介導(dǎo)的。強調(diào)了CVRs設(shè)計中功能性表位的重要性，揭示了由N末端域靶向的S2L20-CVR促進的細(xì)胞進入機制，并揭示了這些表位與病毒進入和膜融合過程之間的關(guān)系。通過這些發(fā)現(xiàn)，研究人員能夠更好地理解CVRs如何促進病毒感染，并為進一步優(yōu)化CVRs設(shè)計提供了重要的信息。

研究者們成功地為來自6個不同亞屬的12種冠狀病毒設(shè)計了具有功能性的CVRs，其中大多數(shù)冠狀病毒缺乏已知受體。研究人員通過生物層干涉法（BLI）測定，確定了所選納米抗體與12種冠狀病毒抗原的結(jié)合動力學(xué)（如圖4所示）。

圖4.納米抗體與固定化病毒抗原結(jié)合的結(jié)合動力學(xué)（圖片來自原文）

為了評估CVR對多輪病毒繁殖的支持，研究者們用HKU3或HKU5刺突蛋白替換VSV-G基因，創(chuàng)建了具有傳播能力的重組水皰性口炎病毒（pcVSVs）。如圖5所示，實驗結(jié)果表明，即使在沒有VSV-G的情況下，CVRs表達(dá)的細(xì)胞依舊可以支持病毒的進入和傳播（c-d），支持病毒的持續(xù)復(fù)制和釋放（e-f）。這些CVRs能夠有效支持病毒的傳播和復(fù)制，證明了CVRs策略在建立不依賴于天然受體的感染模型中的潛力。

圖5.CVRs在支持多種冠狀病毒復(fù)制和擴增方面的能力（圖片來自原文）

最后，研究人員使用CVRs表達(dá)細(xì)胞成功分離和培養(yǎng)了難以培養(yǎng)的真實冠狀病毒，例如RsHuB2019A，這是一種不依賴ACE2的蝙蝠沙貝科病毒。實驗結(jié)果表明，CVRs表達(dá)的細(xì)胞可以支持真實冠狀病毒的擴增。這些數(shù)據(jù)為CVRs在冠狀病毒研究和潛在的抗病毒策略中的應(yīng)用提供了有力的證據(jù)。

定制化冠狀病毒受體（CVRs）的研究成果，為我們打開了一扇通往冠狀病毒研究新世界的大門。它不僅提供了研究這些神秘病毒的新工具，便于更深入地理解冠狀病毒的感染機制，還能加速疫苗和抗病毒-藥物的開發(fā)，同時為全球公共衛(wèi)生安全提供了新的保障，并為未來可能出現(xiàn)的冠狀病毒疫情提供了研究基礎(chǔ)。隨著科學(xué)研究的不斷深入，我們有理由相信，CVRs將在未來的冠狀病毒防控中發(fā)揮越來越重要的作用。

圖6. Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit四片段連接，高GC和短片段組合連接，相比于S品牌，10923菌落數(shù)多，陽性率100%。D：重組轉(zhuǎn)化平板。E：插入片段測序鑒定圖。F：Sanger測序證明1載體與4片段連接成功，連接處測序正確。