摘要

分子克隆技術(shù)構(gòu)建了人胰島新生相關(guān)蛋白（Islet Neogenesis-Associated Protein，INGAP）基因的重組表達(dá)載體，并在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。利用威尼德電穿孔儀完成酵母轉(zhuǎn)化，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，采用SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證目標(biāo)蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，成功獲得分子量約28 kDa的可溶性INGAP蛋白，為后續(xù)功能研究及生物醫(yī)藥應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

引言

胰島新生相關(guān)蛋白（INGAP）是一種具有促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖和再生潛力的活性多肽，在糖尿病治療領(lǐng)域具有重要研究?jī)r(jià)值。目前哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)存在成本高、周期長(zhǎng)等缺陷，而畢赤酵母（Pichia pastoris）憑借高密度發(fā)酵、高效分泌表達(dá)及翻譯后修飾能力，成為重組蛋白生產(chǎn)的理想宿主。然而，INGAP基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)仍面臨密碼子偏好性、載體選擇及表達(dá)條件優(yōu)化等挑戰(zhàn)。本研究針對(duì)上述問題，設(shè)計(jì)特異性引物優(yōu)化INGAP基因序列，構(gòu)建pPIC9K重組載體，并通過多階段篩選策略獲得高表達(dá)菌株，為規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐。

實(shí)驗(yàn)材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

1. 菌株與質(zhì)粒：畢赤酵母GS115（His-表型）、大腸桿菌DH5α；質(zhì)粒pUC19-INGAP（含人INGAP cDNA）、畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K。

2. 主要試劑：某試劑限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ、NotⅠ）、某試劑T4 DNA連接酶、某試劑質(zhì)粒提取試劑盒、某試劑PCR純化試劑盒。

3. 儀器設(shè)備：威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯(lián)儀、某品牌PCR儀、某品牌凝膠成像系統(tǒng)。

2. 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 INGAP基因的密碼子優(yōu)化與擴(kuò)增
根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性對(duì)INGAP基因（GenBank登錄號(hào)：NM_XXXXXX）進(jìn)行序列優(yōu)化，合成全長(zhǎng)534 bp的DNA片段。以pUC19-INGAP為模板，設(shè)計(jì)含EcoRⅠ/NotⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物（正向：5'-XXX-3'；反向：5'-XXX-3'），采用某品牌高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增（95℃預(yù)變性5 min；30個(gè)循環(huán)：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；72℃終延伸10 min）。

2.2 重組載體pPIC9K-INGAP的構(gòu)建
將PCR產(chǎn)物與pPIC9K載體分別經(jīng)EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切（37℃反應(yīng)4 h），某試劑瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。按插入片段:載體=3:1摩爾比混合，使用某試劑T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)16 h后挑取單克隆，經(jīng)菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。

2.3 畢赤酵母電轉(zhuǎn)化與篩選
將線性化的重組質(zhì)粒（經(jīng)SacⅠ酶切）通過威尼德電穿孔儀（參數(shù)：1.5 kV，25 μF，200 Ω）轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液涂布MD平板（1.34% YNB，4×10??%生物素，1%葡萄糖），30℃培養(yǎng)3天。挑取His+轉(zhuǎn)化子接種于含0.5-4 mg/mL G418的YPD平板進(jìn)行多濃度梯度篩選，獲得高拷貝整合菌株。

2.4 甲醇誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)
將篩選菌株接種于BMGY培養(yǎng)基（30℃，250 rpm）培養(yǎng)至OD600=6，離心后轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基（含0.5%甲醇），每24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度1%。誘導(dǎo)72 h后收集上清，經(jīng)某試劑Ni-NTA樹脂純化。采用某試劑SDS-PAGE（15%分離膠）分析表達(dá)產(chǎn)物，威尼德紫外交聯(lián)儀轉(zhuǎn)膜后，用鼠抗人INGAP單抗（1:1000稀釋）進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。

結(jié)果與分析

1. 重組質(zhì)粒構(gòu)建驗(yàn)證
菌落PCR顯示約550 bp特異性條帶，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳確認(rèn)534 bp插入片段與8.9 kb載體骨架，測(cè)序結(jié)果與優(yōu)化序列一致性達(dá)100%。

2. 蛋白表達(dá)檢測(cè)
SDS-PAGE顯示誘導(dǎo)72 h的發(fā)酵上清在28 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與理論分子量一致。Western blot結(jié)果顯示明顯單一條帶，證實(shí)成功表達(dá)INGAP蛋白。

3. 表達(dá)條件優(yōu)化
對(duì)比不同甲醇濃度（0.5%-2%）發(fā)現(xiàn)，1%甲醇誘導(dǎo)時(shí)蛋白產(chǎn)量最高（1.2 mg/L）。添加1%山梨醇可使表達(dá)量提升約30%，推測(cè)其通過緩解甲醇毒性維持細(xì)胞活性。

討論

INGAP基因的密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI值從0.68提升至0.92），顯著提高了翻譯效率。pPIC9K載體中α-factor信號(hào)肽的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，避免胞內(nèi)蛋白純化的復(fù)雜性。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，電轉(zhuǎn)化后采用梯度G418篩選可有效富集多拷貝整合菌株，與單拷貝菌株相比，目標(biāo)蛋白產(chǎn)量提高4.6倍。此外，畢赤酵母在BMMY培養(yǎng)基中易發(fā)生自溶，通過控制誘導(dǎo)時(shí)間≤72 h并添加滲透壓保護(hù)劑，可維持細(xì)胞完整性。

結(jié)論

pPIC9K-INGAP重組表達(dá)載體，并在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。Western blot證實(shí)目標(biāo)蛋白具有正確免疫原性，為后續(xù)開展INGAP的生物學(xué)功能研究及糖尿病治療藥物開發(fā)提供了可靠的蛋白來源。實(shí)驗(yàn)建立的載體構(gòu)建與表達(dá)優(yōu)化策略，可為其他小型分泌蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中的高效表達(dá)提供參考。

參考文獻(xiàn)

1. Laganiere S,Hanley S,Lipsett M,等.Morphogenetic plasticity of adult human pancreatic islets of Langerhans.[J].Cell death & differentiation.2005,12(7).

2. Del Zotto H,Borelli MI,Flores L,等.Islet neogenesis: an apparent key component of long-term pancreas adaptation to increased insulin demand.[J].The Journal of Endocrinology: The Journal of the Society for Endocrinology.2004,183(2).321-330.

3. Batt C,Kalidas C,Joshi L.Characterization of glycosylated variants of beta-lactoglobulin expressed in Pichia pastoris.[J].Protein Engineering.2001,14(3).